基于微卫星标记的不同地区乌鳢和白化乌鳢群体遗传多样性研究

张 露,樊 威,苏 建,焦晓磊,周 剑,黄志鹏,赵 瀚,赵仲孟,段元亮,李 强,杜 军,卓 婷,苏全森,吴 俊,罗 煜

(1. 四川省农业科学院水产研究所，成都 611731； 2. 四川省内江市农业科学院，四川 内江 641199)

【研究意义】乌鳢(Channaargus)是鳢科鱼类中分布最广、产量最大的种类[1]，广泛分布于长江流域以及北至黑龙江一带，而白化乌鳢主要分布在嘉陵江中下游流域。乌鳢身上花纹黑白相间，生性凶猛，繁殖力极强，白化乌鳢体形和生活习性等与普通乌鳢相同，但白化乌鳢体色呈较单一的白色或灰白色[2]；乌鳢和白化乌鳢都具有生长速度快、适应性强、肉质细嫩、味道鲜美、少刺等特点，且白化乌鳢还具有一定的药用价值，深受消费者喜爱[3]。随着乌鳢和白化乌鳢市场需求量的不断增大，其养殖规模不断增大，但部分乌鳢和白化乌鳢养殖群体仍存在个体表型差异较大、遗传背景不清楚等问题，对乌鳢和白化乌鳢遗传多样性的研究可以为其种质资源保护和选育提供科学依据。【前人研究进展】乌鳢和白化乌鳢曾被认为是2个不同的物种，后来有研究通过对两者的形态特征、乳酸脱氢酶、酯酶同工酶、染色体类型和线粒体等进行了多方面的比较，认为白化乌鳢不能被划分为单独的亚种，应视为普通乌鳢的白化变种[4]。目前对白化乌鳢的研究主要集中在繁育技术[5]、养殖管理[3, 6]、染色体核型[7]、疾病防治[8-9]和营养成分[2, 10]等方面，对于现有白化乌鳢资源的遗传多样性的研究相对较少。微卫星标记具有中性、共显性和高度多态等特点，是非常适合用于群体遗传研究的分子标记[11]。微卫星标记作为种群遗传分析最有效的分子标记之一，被广泛运用于以飘鱼、黄颡鱼、花鲈等为代表的鱼类群体遗传多样性研究[12-14]。近年来，已有许多乌鳢微卫星标记开发及利用的研究报道，其中Gul等[15]从乌鳢基因组文库中分离出了10个二碱基重复微卫星位点；King等利用磁珠捕获技术从乌鳢中获得了19个四碱基重复的微卫星位点[16]；温晓曦等[17]利用磁珠富集法结合放射性同位素杂交方法分离乌鳢的微卫星分子标记，并报道了19个多态性微卫星位点，包括3个二碱基重复和16个三碱基重复的微卫星位点；随后Yan等[18]通过FIASCO法构建乌鳢微卫星文库，筛选到了18个多态性微卫星位点，包括1个二碱基重复微卫星位点和17个四碱基重复微卫星位点，这些标记的开发为乌鳢遗传多样性的研究提供了基础。微卫星标记已被应用于乌鳢养殖群体的遗传多样性研究，有研究分别采用10和14个乌鳢微卫星标记对我国不同地理位置的乌鳢养殖群体遗传多样性进行了研究，并分析了现有乌鳢养殖群体间的遗传距离，为乌鳢的选育提供了基础数据[19-20]。然而目前对于利用微卫星标记对不同地区白化乌鳢群体的研究还鲜有报道。【本研究切入点】为探明白化乌鳢与乌鳢养殖群体遗传多样性，本研究采用20个微卫星标记对不同地理位置的乌鳢和白化乌鳢群体微卫星位点的遗传多样性和遗传分化特征进行分析。【拟解决的关键问题】本研究拟为乌鳢和白化乌鳢群体的遗传资源保护及综合利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集与DNA提取

7个不同地理位置的4个乌鳢群体和3个白化乌鳢育成群体的样本采集信息见表1。采集肌肉或鳍条组织样本，用90%的酒精保存待用。采用Ezup柱式动物基因组DNA抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取样本DNA，提取方法按照试剂盒说明书操作。提取的DNA采用1%琼脂糖凝胶电泳检测完整性，放-20 ℃保存备用。

表1 乌鳢和白化乌鳢群体样本采集信息Table 1 Sampling locations and information for Channa argus and Albino Channa argus populations populations

1.2 PCR扩增及产物检测

采用前人开发的20对乌鳢微卫星引物(表2)对所有群体进行PCR扩增[16, 18]。PCR反应体系为25 μL：12.5 μL 2×TaqPCR Mix(生工生物工程(上海)股份有限公司)、1 μL模版DNA、上下游引物各1 μL、9.5 μL ddH2O。PCR扩增程序为：95 ℃预变性3 min，进行35个循环扩增(95 ℃ 30 s，55 ℃ 40 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃延伸5 min，最后12 ℃保存。STR基因分型和引物合成均委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成。

表2 用于本研究的微卫星引物相关信息Table 2 Primers used in the present study

1.3 数据分析

采用CERVUS 3.03[21]进行哈迪温伯格平衡(Hardy-Weinberg equilibrium,HWE)检验，并计算等位基因数(Na)、观测杂合度(Ho)、期望杂合度(He)和多态信息含量(PIC)。利用Arlequin 3.5[22]进行分子方差分析(AMOVA)和遗传分化指数(F-statistics，FST)分析，并使用MEGA 5.0[23]软件基于Nei’s遗传距离构建UPMGA系统发育树。

2 结果与分析

2.1 微卫星位点多态性

如表3所示，所有20对微卫星引物共检测出356个等位基因，Na介于4～40，每个位点平均有17.8个等位基因。Ho介于0.000～0.791，平均值为0.578；He介于0.310～0.910，平均值为0.732；PIC值介于0.271～0.901，平均值为0.700，其中16个位点均具有高度多态性(PIC>0.5)，位点CarA118、CarC104、CarC116和CA04多态性相对较低。哈迪温伯格平衡检验(HWE)显示位点CarA118和CarC104未显著偏离哈迪温伯格平衡，其他位点均显著偏离哈迪温伯格平衡。

表3 微卫星位点遗传多样性参数Table 3 Genetic diversity parameters among 16 loci of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.2 群体遗传多样性

对4个乌鳢和3个白化乌鳢群体的遗传多样性分析结果(表4)显示，7个群体的Na为3.45～13.90，Ho为0.399～0.757，He为0.397～0.785，PIC值为0.344～0.753，其中HZ群体PIC值最高，且所有乌鳢群体的Na、Ho、He、PIC均高于白化乌鳢群体。

表4 乌鳢和白化乌鳢群体的遗传多样性Table 4 Genetic diversity of Channa argus and Albino Channa argus populations

2.3 群体的遗传分化

7个群体的遗传分化指数FST在0.07876～0.4030(表5)，所有群体间的遗传分化均达显著水平(P<0.05)。3个白化乌鳢群体间的FST值为0.08 785～0.12 342，4个乌鳢群体间的FST值为0.07 876～0.17 185，白化乌鳢和乌鳢群体间的FST

表5 不同群体间的遗传分化指数(FST)Table 5 fixation indexes (FST) among Channa argus and Albino Channa argus populations

值为0.22 290～0.40 303，两组不同乌鳢群体之间的FST值相对高于组内群体间的FST值。

将4个乌鳢群体和3个白化乌鳢群体分为两组进行AMOVA分析(表6)，这几个群体的遗传变异主要来源于个体内，占遗传变异来源总量的69.65%，有19.95%的遗传变异来自组间，9.64%来自于组内群体间。

表6 乌鳢和白化乌鳢群体的分子方差分析Table 6 AMOVA analysis among the Channa argus and Albino Channa argus populations

通过UPGMA系统发育树聚类结果可以看出4个乌鳢群体和3个白化乌鳢群体分别被聚类到了2个独立分支上(图1)，4个乌鳢群体中WH和JR群体遗传距离较近，而3个白化乌鳢群体中LS和NJ群体的遗传距离相对更近。

图1 乌鳢和白化乌鳢群体UPGMA系统发育树Fig.1 UPGMA phylogenetic tree of Channa argus and Albino Channa argus populations

3 讨 论

遗传多样性与物种的生存力、适应力和进化潜力密切相关，是评估种群资源状况的重要依据，等位基因数、杂合度、多态信息含量等遗传参数是反应群体遗传多样性的主要参数[24]。本研究所有的356个等位基因，Ho介于0.000～0.791，平均值为0.578；He介于0.310～0.910，平均值为0.732，相对与Zhu等[19]对4个不同地区乌鳢群体的微卫星标记的研究中其Ho和He值分别为0.70～0.84和0.69～0.83，通过与前人对乌鳢的研究比较显示，本研究中的群体Ho和He处于相对较低水平，有研究指出当群体杂合度在0.5～0.8即可认为具有较高的多样性[24]，本研究的乌鳢群体杂合度均值均高于0.5，总体看来遗传多样性较丰富。此外，本研究中的20个微卫星标记PIC值介于0.271～0.901，根据Botstein等[25]的标准PIC≥0.5为高度多态性，本研究中有16个位点具有高度多态性(PIC> 0.5)，这些微卫星位点为乌鳢和白化乌鳢提供了丰富的遗传信息，可用于乌鳢和白化乌鳢遗传多样性的评估。

通过对4个乌鳢和3个白化乌鳢群体的遗传多样性分析发现所有在所有群体中WH和HZ群体的Na均大于13个，而DH和JR群体的Na均大于6个，而3个白化乌鳢RC、NJ、LS群体的Na均小于4个，乌鳢群体的Na均高于白化乌鳢，且所有乌鳢群体的Ho和He均高于白化乌鳢群体。通过对两种乌鳢的PIC值估算发现白化乌鳢的PIC值为0.344～0.414，处于中度多态水平，而乌鳢的PIC值为0.513～0.753，处于高度多态水平，可见白化乌鳢群体的遗传多样性要低于乌鳢群体，在繁育过程中应加强白化乌鳢遗传多样性保护，尽量避免近亲交配。

遗传分化指数FST是用来衡量群体间遗传分化程度的重要参数，7个群体的FST在0.07 876～0.40 303，且所有群体间的遗传分化均达显著水平(P<0.05)，表明群体间均存在一定的遗传分化。乌鳢群体和白化乌鳢群体间遗传分化较大，白化乌鳢和乌鳢群体间的FST值为0.22 290～0.40 303，其中白化乌鳢LS群体和乌鳢DH群体间遗传分化最大(FST=0.40 303)。3个白化乌鳢群体间的FST值为0.08 785～0.12 342，4个乌鳢群体间的FST值为0.07 876～0.17 185，2组乌鳢群体在组内群体间遗传分化相对较小。将4个乌鳢群体和3个白化乌鳢群体分为2组进行AMOVA分析可以发现这几个群体的遗传变异主要来源于个体内和组间，组内群体间变异来源较少。而UPGMA系统发育树聚类结果显示4个乌鳢群体和3个白化乌鳢群体分别被聚类到了2个独立分支上，表明乌鳢和白化乌鳢间群体间有较明显的遗传差异，已有研究推断白化乌鳢是乌鳢白化变异形成的群体[4, 7, 26]，而根据本研究结果可以推断白化乌鳢经过长期的人工定向选育，已经开始逐步分化为1个与乌鳢存在较大遗传差异的独立群体。

4 结 论

综上所述，本研究结果表明3个白化乌鳢群体的遗传多样性均相对低于4个乌鳢，在繁育过程中应加强白化乌鳢遗传多样性保护，尽量避免近亲交配，本研究为乌鳢和白化乌鳢的遗传资源保护及综合利用提供理论依据。