对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

发表时间:2022/01/24 19:30:02  浏览次数:9091  
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对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

肝肠胞虫

Enterocytozoon hepatopenaei, EHP(肝肠胞虫)属于真菌界、微孢子门、肠胞虫属,是一种可感染多种真核生物的专性细胞内寄生虫,2009年在泰国生长缓慢的斑节对虾中被首次发现分离而命名,其全名为“肠道上皮细胞微孢子虫”。

自2013年以来,我国各地养殖的南美白对虾先后出现EHP的感染,感染率居高不下,造成对虾生长缓慢,养殖户经济效益显著下降,已成为制约南美白对虾养殖业健康发展的最主要病害之一。

2017年,国家虾蟹产业技术体系开展的被动监测结果显示,EHP已在我国虾类主要养殖区广泛分布,在山东、河北、江苏、上海、浙江、福建、广东、海南和新疆均有不同水平的检出。

除我国外,泰国、印度、文莱、越南、委内瑞拉、印度尼西亚和马来西亚等国均有EHP检出。在印度东海岸西孟加拉邦的对虾人工养殖中发病率高达84.9%。

在泰国,EHP引起的HPM(对虾肝胰腺微孢子虫病,hepatopancreatic microsporidiosis, HPM)已经成为继白斑病和急性肝胰腺坏死病后影响泰国对虾养殖的第三个最棘手的问题。

对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

极管是肝肠胞虫感染的主要结构,在未感染时,极管在孢子细胞内呈螺旋状缠绕,当孢子进入宿主体内感受到环境变化时,孢子内压力增大导致其极管外翻并弹出,极管弹出的同时将孢子内的遗传物质注射入宿主细胞内,随后遗传物质在宿主细胞内吸取养分进行复制、分裂,从而实现孢子的繁殖。由于EHP是在细胞内繁殖,传统杀虫药很难对其奏效。

对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

肝肠胞虫感染细胞的过程

生活史和入侵机制

微孢子虫生活史大致分为3个部分:

1感染期

环境中的成熟孢子弹出极管,像“注射器”一样刺入宿主细胞的细胞质。孢原质通过弹出的极管管腔释放,极管先端形成芽体,芽体进入宿主细胞内。

2裂殖增殖期

芽体在侵入宿主细胞内后的几小时内,保持最初的圆形,大小则逐渐增大,随后芽体以二分裂或多分裂逐渐增大发育为裂殖体,然后变异为母孢子,此过程反复进行,母孢子数量增加,从而进入孢子增殖期。

3孢子增殖期

母孢子以二分裂方式形成孢子母细胞,并由孢子母细胞发育为成熟的孢子,标志着一个生活史的完成。

对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

对虾肝肠胞虫(EHP)宿主广泛,目前已知可感染的虾类宿主有南美白对虾、斑节对虾、日本囊对虾、罗氏沼虾、南美蓝对虾;除此之外,在鱿鱼、沙蚕、商品化冷冻桡足类、商品化卤虫卵及卤虫幼体、冰冻成体卤虫也能检出。

EHP专性寄生于细胞内,在细胞外部无法繁殖,因其基因组已缺失了许多重要的代谢相关基因,必须要由寄主细胞提供。

EHP主要感染对虾肝胰腺、肠道、血淋巴、肌肉、鳃。在肝胰腺细胞内形成孢原质,成熟后经消化道排出体外,孢子壁较厚,药物难进入。

EHP无需中间宿主,可通过如下方式进行感染——

  • 产生的子代孢子感染新的细胞,或通过肠道排出感染其它虾;
  • 垂直传播:种虾感染仔虾;
  • 水平传播:摄食携带EHP的鲜活饵料、病死虾或环境中的孢子体均能感染;
  • 昆虫摄食传播:如蜻蜓等。

EHP个体微小,感染EHP的对虾症状不明显,因此很难在现场确诊。简便、快速且灵敏度高的分子生物学方法已成为实验室检测EHP的常规手段。

由于EHP的宿主广泛,传播过程中不需要中间寄主,既可通过水体又可以通过摄食进行传播,加大了EHP的预防难度。当EHP受到胁迫时会吐出极丝,空塘时可采用提高pH值的方式,胁迫其极丝放出,使孢子因找不到宿主寄生而死亡。但对虾体内的肝肠胞虫不能采用提高pH值的方法来清除,否则会在肝胰腺内快速增殖。另外,还可采用消毒剂、改变温度等方法,抑制EHP孢子的活力,如将温度提高到75°C,EHP的孢子在1分钟内失活(Munkongwongsiri 等,2021)

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EHP孢子纯化和出芽

对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控
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pH值和温度对肝肠胞虫孢子喷射率的影响 (引自诺维信Danny)

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28°C下EHP的孢子状态; 75°C下45 秒EHP的孢子状态; 75°C下60 秒EHP的孢子状态

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高锰酸钾、氯制剂和乙醇消毒后对EHP孢子喷射的影响(引自诺维信Danny)

虾肝肠胞虫对虾的影响

对虾感染EHP的危害严重程度取决于其孢子在肝胰脏中的数目,孢子的数目越多,对虾生长的影响越大,具体表现为以下几点:

⑴虾肝肠胞虫寄生于对虾肝脏及肠道细胞内,造成吸收功能下降,营养不良导致对虾生长缓慢,同一池塘的虾规格参差不齐。生长缓慢的虾因体瘦弱抗病力差,蜕壳期出现零星死亡,如遇异常天气和水质突变等应激时可造成大量死亡。

⑵有研究认为感染虾肝肠胞虫的对虾存在肝胰腺坏死的风险,EHP是对虾急性肝胰腺坏死(AHPND/EMS)和败血性肝胰腺坏死(SHPN)的一个危险因素,EHP感染增强了对虾AHPND、SHPN感染的敏感性,加重了肝胰腺细胞的坏死和脱落,提高了AHPND和SHPN的死亡率。2019年利洋公司调查发病池塘也发现对虾肝胰腺坏死与虾肝肠胞虫具有密切联系。可能和EHP感染导致虾免疫力降低,机体更容易被细菌、病毒等微生物入侵,引起交叉感染有关。

⑶2010年越南有学者认为对虾白便综合征是由虾肝肠胞虫引起。2016年有报道发现,经历白便综合征与没有白便综合征的虾肝胰脏组织及池塘中的EHP呈负相关关系,即经历白便综合征的虾肝胰脏组织及池塘中的EHP含量高于没有白便综合征的虾或池塘,认为对虾白便症与虾肝肠胞虫存在关联。

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发病虾生长缓慢,规格参差不齐

虾肝肠胞虫的流行特点

EHP孢子“耐受性”极强(有专家认为可以耐受长达50年的干燥),没有明显的易感水温或季节,在苗种培育和成虾养殖阶段均有出现。具有如下传播和发病特点:

⑴传播方式

虾肝肠胞虫感染对虾可水平传播或垂直传播,即虾经口摄食寄生虾肝肠胞虫的病虾、饵料(如沙蚕、桡足类、轮虫、卤虫等)或环境中的孢子体而感染,或通过亲虾传播给子代。

其在宿主细胞内繁殖,通过粪便排出体外,在水环境中形成孢子体,散在分布于水体或附着于藻类、碎屑、饲料表面及底泥环境中,孢子可在养殖环境中累积进行传播。

⑵影响因素

据相关调查发现,感染虾肝肠胞虫发病的对虾池塘具有如下特点:养殖密度越低,感染EHP的几率也越低;高盐度养殖对虾相对低盐度感染EHP的几率增加;池塘有机质越多,患病风险越高,可能与微孢子虫的中间寄主生活环境有关。其孢子数目与养殖天数成正比,养殖天数越长,孢子数目越多,特别是在养殖40天左右,会出现一个暴发的高峰期。

发病诊断

虾肝肠胞虫虫体较小,采用光学显微镜进行压片镜检虫体的形态特征较难确诊,通常是采用实验室普通PCR或套式PCR、实时荧光定量PCR、环介导等温扩增技术(LAMP)等方法对其进行定性、定量检测。另外,固定样品做组织病理切片,观察对虾肝脏有大量虾肝肠胞虫,发病虾肝胰腺组织严重病变,肝胰腺腔体变小或消失,部分肝胰腺上皮细胞出现坏死或脱落,说明对虾已产生危害。一般认为肝胰腺中EHP在103copies/ng DNA以上可能代表较高的风险。

对虾养殖:浅析肝肠胞虫及其诊断防控

发病南美白对虾肝胰腺组织切片可见虾肝肠胞虫

虾肝肠胞虫的防控

虾肝肠胞虫的孢子壁较厚,可达10nm,且成熟的孢子具有一层坚韧的几丁质外壳,一般药物难进入虫体,目前针对该病尚未发现确切有效的治疗药物或措施,只能根据其流行特点进行防控。

⑴清塘灭孢

有研究发现经过砂滤、臭氧消毒、紫外消毒等一系列处理后的养殖用水未检测到EHP,证实消毒处理可以预防EHP感染和传播。所以,对于EHP发病率高的地区(如珠三角土塘养殖)、对虾生长缓慢的养殖池塘需进行彻底全面的清塘消毒。如翻耕塘底(10厘米左右),使用400公斤/亩以上的生石灰彻底清淤,使塘底的pH值达到12,并保持一段时间,之后塘底完全晒干,可有效杀灭微孢子虫。

⑵水源、工具、饵料消毒

氯制剂、高锰酸钾等消毒,处理养殖水源中的野虾野蟹、浮游生物及水体中的孢子虫。日常养殖生产用具等必须进行严格的消毒后再使用。投喂沙蚕、卤虫、丰年虫等活饵时,建议经过冷冻、巴氏消毒或者X射线消毒以后再使用,避免摄食携带病原的饵料生物。

⑶加强检疫

EHP可垂直传播,所以须严格对亲虾及苗种进行检疫,培育无特定病原(SPF)虾苗,可有效降低对虾EHP感染率。亲虾培育池要彻底清洗干燥后用氢氧化钠消毒,所有设备均要在2.5%的氢氧化钠溶液中浸泡至少3个小时,充分晾干,使用前再用200ppm、pH值低于4.5的盐酸喷洗处理。

⑷提高免疫力

内服保肝护肠药物(如益生菌、中草药、维生素等),提高免疫力,避免病原“趁虚而入”。

⑸控制其它影响因素

如控制养殖密度不宜过高;低盐度水体进行养殖;勤调水改底,减少池塘有机质等具有一定的防控作用。另外,及时清理发病虾和死虾,不随意排放发病池塘养殖尾水,对防止虾肝肠胞虫的传播范围进一步扩大十分重要。

另外,有研究表明维持水体中的氨氮、亚硝酸盐在一定浓度范围内(氨氮6-9mg/L、亚硝酸盐10mg/L),可以有效控制虾体内EHP携带量,但并不能杀死EHP,在实际养殖生产中适用性不强。

(来源:礼蓝水产,利洋水产;综合:西南渔业网)

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