随着蛙类养殖业在我国的一些地方快速兴起，危害养殖牛蛙（Rana catesbeiana）的各种病害问题也日渐突出。有研究结果表明，严重危害养殖蛙的病害种类较多，如由箭毒蛙壶菌（Batrachochytrium dendrobatidis）引起的真菌性疾病、由虹彩病毒（iridoviuses）引起的病毒性疾病、由米尔伊丽莎白菌（Elizabethkingia miricola）等致病性细菌引起的细菌性疾病以及由泰国肝吸虫（Opisthorchis viverrini）等各类寄生虫引起的寄生虫疾病。除这些由病原性生物引起的生物性疾病外，还有由各种恶劣养殖环境因素造成养殖蛙类的非生物性病害。

迄今为止，对患病牛蛙生物性疾病的研究结果证明，细菌性疾病是危害养殖蛙类的主要生物性病害。目前已经报道的能严重危害养殖牛蛙致病性细菌也有很多种，如脑膜脓毒性黄杆菌（Flavobacterium menigosepticum）可引起牛蛙歪脖子等症状；有多种属于气单胞菌属（Aeromonas）致病性细菌的感染，可引起牛蛙出现红腿病、败血症、腹水病和白内障等多种症状的疾病。另外，也有研究结果证明不同种类的致病性细菌，还可能会导致牛蛙出现非常类似的疾病症状，如迟缓爱德华菌（Edwardsiella tarda）、嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）、点状产气单胞菌（Aeromonas punctata）、非霍乱弧菌（Noncholera vibrios）等致病性细菌，均可导致养殖牛蛙出现细菌性败血症（bacterial septicemia）的相似症状。

对于牛蛙在内的水产养殖动物细菌性疾病，国内外的水产动物病害防控研究者以及养殖业者，大多都是依靠对致病性细菌具有良好抑菌效果的抗微生物药物治疗。我国的部分水产养殖动物病害研究者，从患病牛蛙体内分离致病性细菌后，也进行过对分离菌株的抗微生物药物敏感性检测。因为致病性细菌对于抗微生物药物容易产生抗药性（drug resistance），如果在治疗水产养殖动物细菌性疾病的过程中，长期滥用某种抗微生物药物，就会引起致病性细菌对这种药物耐药性的快速产生，最终导致面对水产养殖动物的各种细菌性疾病而无有效药物可用的局面。

本研究利用从我国一些牛蛙养殖区送来的患病牛蛙，在观察其外观症状的基础上，从患病牛蛙体内分离获得多株优势菌株，完成了分离菌株对多种抗微生物药物耐药性检测。建议牛蛙养殖业者选择适宜的抗微生物药物，做到精准用药，提高了药物对患病牛蛙的治疗效果与成功率。

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材料与方法

1.1 患病牛蛙来源

本研究中大部分患病牛蛙来自安徽省、湖北省、湖南省和广东省的部分牛蛙养殖场。送检患病牛蛙均由各地的牛蛙养殖场，通过快递方式送到实验室。实验室人员在收到患病牛蛙后，立即打开包装检查患病牛蛙的存活状态（图1）。将在运输途中已经死亡的患病牛蛙剔除，只留下尚未死亡的患病牛蛙做体内致病性细菌分离，并利用纯化后的分离菌株完成对抗微生物药物的药物敏感性检测。

图1通过快递送到实验室的存活患病牛蛙状态

1.2 患病牛蛙外观症状与寄生虫检查

患病牛蛙的外观症状，在依靠肉眼观察病记录牛蛙疾病的症状，主要有红腿、溃疡、白内障、腹水和歪头等外观典型症状（图2）。

图2肉眼观察患病牛蛙疾病的主要外观症状

参照寄生虫学检查方法，用解剖刀从患病牛蛙体表刮取少量黏液，制作水浸片后置于显微镜下观察，以确认患病牛蛙体表是否寄生有某些种类的寄生虫。

1.3 致病性细菌菌株分离与纯化

图3示从患病蛙体内采集细菌的位置

在无菌条件下解剖患病牛蛙，从其肝脏、肾脏和脑等器官和组织中（图3）分离致病性细菌，在脑心浸液琼脂培养基（BHIA，Difco）平板上作划线后，将接种后的培养皿置于28℃恒温培养箱中，培养36~48 h后，从生长出菌落中挑取单个菌落进行纯培养，以获取纯化的分离菌株（图4）。

图4示从患病牛蛙体内分离并纯化的分离菌株

先后共分离纯化到多个优势菌株，将纯化后的分离菌株置于4℃冰箱中保存，供作分离菌株对抗微生物药物的药物敏感性检测。

1.4 供试抗微生物药物

采用水产用抗微生物药物（“国标渔药”）作为本试验的供试药物。含量为10.0%的复方磺胺氯达嗪钠粉、10.0%的延胡索酸泰妙菌素、10.0%的阿莫西林可溶性粉、10.0%的氟苯尼考粉、10.0%的恩诺沙星粉、10.0%盐酸土霉素可溶性粉、13.0%的金霉素粉、10.0%的硫酸新霉素可溶性粉等8种抗微生物药物。

1.5 最小抑菌浓度（MIC）的测定

依日本化学疗法学会制定的标准法进行。即首先将供试抗微生物药物用适宜的容媒预溶后，用灭菌生理盐水按照上述制剂中抗微生物药物的含量，分别稀释至1000~0.25mg/L的２倍稀释的13个浓度。然后用脑心浸液培养基（BHI，Difco）将各浓度的药物液稀释10倍，从而使培养基中的各种药物的浓度达到100.0~0.025mg/L的２倍稀释的13个浓度。最后向每支盛有2.9 mL培养基的试管中加入0.1 mL浓度为1.2×10 6cfu/mL活菌液，在28℃条件下连续培养3d，经肉眼观察证实无细菌生长试管中的最低药物浓度，即为某种抗微生物药物对分离菌株的最小抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）。

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结果

2.1 分离菌株对各种抗微生物药物的MIC

本试验中先后完成了从各地养殖的患病牛蛙体内分离并纯化的30多个菌株，对8种供试抗微生物药物的药物感受性检测结果如图1所示。从图1所示结果可以看出，从来自不同地区养殖患病牛蛙中获得的分离菌株，对各种抗微生物药物的MIC是有所不同的。

图1各种抗微生物药物对患病牛蛙分离菌株的最小抑菌浓度（MIC）

来自不同地区养殖患病牛蛙中分离菌株对抗微生物药物敏感性检测结果如表1所示。从表1所示分离菌株对各种抗微生物药物的MIC存在明显差异。但是，分离菌株对供试药物感受性的共同特点是，对复方磺胺氯达嗪钠粉和阿莫西林可溶性粉的MIC值最大。而对其它供试药物存在不同的感受性。

2.2 药物的投喂与药物治疗效果

根据各种抗微生物药物对来自不同地区患病牛蛙中分离菌株的MIC检测结果，选择用于治疗患病牛蛙的抗微生物药物。根据从来自安徽省境内养殖患病牛蛙中分离的AH001菌株，对恩诺沙星粉的MIC为3.13mg/L，建议牛蛙养殖者选择恩诺沙星粉作为患病牛蛙的治疗药物，计算每天的用药量为3.13mg/L×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg恩诺沙星，因为恩诺沙星粉制剂含量为10.0%，所以需要在每公斤牛蛙饲料中添加200.0mg）。依次类推，计算来自湖南省境内养殖患病牛蛙中分离的HN002菌株，对盐酸土霉素的MIC为3.13mg/L，建议牛蛙养殖者选择盐酸土霉素可溶性粉作为患病牛蛙的治疗药物，计算每天的用药量为3.13mg/L ×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg盐酸土霉素，用盐酸土霉素可溶性粉制剂含量为10.0%，需要在每公斤牛蛙饲料中添加200.0mg）。计算来自湖北省境内养殖患病牛蛙中分离的HB003菌株，对恩诺沙星粉的MIC为3.13mg/L，建议牛蛙养殖者选择恩诺沙星粉作为患病牛蛙的治疗药物，计算每天的用药量为3.13mg/L ×6.3=19.719mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂20.0mg恩诺沙星，用恩诺沙星粉制剂时需要在每公斤牛蛙饲料中添加200.0mg）。计算来自广东省境内养殖患病牛蛙中分离的GD004菌株，对恩诺沙星粉的MIC为12.5mg/L，建议牛蛙养殖者选择恩诺沙星粉作为患病牛蛙的治疗药物，计算每天的用药量为12.5mg/L ×6.3=78.75mg/kg（即按照每公斤牛蛙，每天投喂79.0mg恩诺沙星，用恩诺沙星粉制剂时需要在每公斤牛蛙饲料中添加790.0mg）。

按照上述的检测结果、选择治疗患病牛蛙的抗微生物药物并计算用药量，指导不同地方牛蛙养殖场选择相应药物，精准用药治疗患病牛蛙的疾病，均获得了理想的药物治疗结果。

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3.1 患病牛蛙主要外观症状

来自不同地方的患病牛蛙，虽然显示出疾病不同的外观症状，如有红腿病、败血症、腹水病和白内障等疾病外观典型症状。但是，从其患病蛙体内分离细菌菌落特征则有大致相同的均一形态，说明感染牛蛙并导致其出现疾病典型症状的致病性细菌，可能就是同一种细菌。

针对从患病牛蛙体内分离菌株，完成的对各种抗微生物药物的药物敏感性检测结果，并且根据药物敏感性检测结果选择治疗疾病的药物和计算其用药量，在养殖现场治疗牛蛙疾病过程中，均获得了良好的药物治疗效果。说明这些分离菌株就是引起这些患病牛蛙出现各种症状的“元凶”，同时也证明了我们采用的这种筛选治疗药物的方法和计算用药量的方法，在养殖现场治疗患病牛蛙的疾病是可行的。

3.2 分离菌株抗药性差异的原因分析

在本次选择的8种供试药物中，来自不同地区患病牛蛙中分离菌株，均对复方磺胺氯达嗪钠粉和阿莫西林可溶性粉显示出不敏感，前者可能是因为分离菌株对磺胺类药物已经产生了较严重的抗药性，而后者可能是分离菌株属于革兰氏阴性菌，对阿莫西林具有先天性耐药性的缘故。

从不同地方患病牛蛙中获得的分离菌株对其他几种抗微生物药物，均显示了不同程度的药物敏感性，可能是因为在不同地方使用各种抗微生物药物的频率不同，导致致病性细菌对各种抗微生物药物产生了不同程度的耐药性所致。而从不同地方患病牛蛙中获得的分离菌株，均恩诺沙星粉显示出较好的药物敏感性，可能是这种抗微生物药物不易导致致病新细菌产生耐药性的缘故。

(作者：华中农业大学 陈昌福，武汉科研时代生物技术有限公司 周鑫军)