气体过饱和对草鱼和鲢受精卵、仔鱼和幼鱼的影响

吴 凡，杜开开，柳 凌，魏 念，倪朝辉，李云峰

(中国水产科学研究院长江水产研究所，农业农村部长江中上游渔业生态环境监测中心，武汉 430223)

大坝在汛期开闸泄洪，空气在高压的作用下溶入到高速排出的洪水中，导致大坝下游水体出现溶解气体过饱和的现象[1]，形成的气体过饱和水随着河道流动到下游从而影响水中的水生生物正常的生命活动[2]。气泡病是水生生物常见的疾病，主要由鱼类暴露于气体过饱和水体中导致，严重时影响鱼体正常的生命活动。20世纪60年代，哥伦比亚河大坝泄洪导致水体出现气体过饱和的现象引起了广泛关注。此后，科研人员针对气体过饱和对水生生物(主要是鲑科鱼类)的影响进行了大量研究[3]，并试图通过优化大坝结构以及泄水操作以降低水坝泄水时水体中溶解性气体的饱和度。根据现行美国环境保护局水质标准规定，水环境中溶解气体饱和度应低于110%，但大坝泄水时往往无法满足这一条件[4]。

水体中气体过饱和现象是一直存在的环境质量问题，虽然国内外对大坝泄洪时下游河流中气体过饱和的形成和释放机制进行了一些研究[5,6]，但形成的气体过饱和水体对水生生物影响的研究仍相对缺乏。国外研究人员观测到大坝泄洪时下游水体的溶解气体含量会急剧升高，鱼体内的溶解气体含量也在升高，导致鱼类死亡率升高[7,8]。Antcliffe等[9]研究发现暴露于气体过饱和水体的虹鳟幼鱼会出现行动迟缓和死亡前不规则游动的现象。Earl等[10]研究发现水体里气体饱和度的变化对鱼类的影响存在差异。随着国家对西部地区发展建设的重视，长江上游到金沙江流域建立和规划了近20座高体大坝，汛期泄洪导致下游水体中气体过饱和的现象日益严重。已有研究表明在三峡大坝和向家坝在泄洪期间下游水体的溶解气体会出现过饱和的现象[11,12]。袁嫄等[13]通过长薄鳅在气体过饱和水体里的再暴露实验发现低饱和度对鱼类的影响较小。董杰英等[14]分析了草鱼(Ctenopharyngodonidella)、鲢(Hypophthalmichthysmolitrix)和鳙(Hypophthalmichthysnobilis)这三种经济鱼类在气体过饱和水中的敏感性差异。虽然国内外都开展了一些溶解气体过饱和水对鱼类生长发育的影响研究，但对这些鱼类早期发育阶段的影响研究相对较少。本文通过研究气体过饱和水体对草鱼、鲢早期发育的三个阶段(受精卵、仔鱼和幼鱼)的耐受性，分析不同饱和度的气体过饱和水体对它们不同的发育时期的影响，从而为长江流域水生生物的环境保护以及解决高坝泄洪产生的气体过饱和水体对鱼类的影响提供研究基础，并为建立气体过饱和标准体系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验鱼来源

实验用草鱼(受精卵、仔鱼、幼鱼)，鲢(受精卵、仔鱼、幼鱼)均取自中国水产科学研究院长江水产研究所荆州窑湾实验场。草鱼卵为受精后7 h，孵化水温在(25.0±0.5)℃；草鱼仔鱼为出膜后4 d；草鱼幼鱼体长为(5.82±0.40)cm，体重为(4.06±0.81)g。鲢卵为受精后9 h，孵化水温在(25.0±0.5)℃；鲢仔鱼为出膜后3 d；鲢幼鱼为体长(2.21±0.24)cm，体重(0.17±0.08) g。

1.2 气体过饱和发生和实验装置

本研究的设备由作者及所在学科组设计和制作。设备包括气体过饱和发生装置和气体过饱和实验装置两部分组成。

气体过饱和发生装置由水泵、蓄水池、压力罐、空气压缩机、管道等部件组成(专利号ZL 2017 2 0786771.7)(图1)。可以模拟高坝泄水时所生成的高饱和度的气体过饱和水，再通过和自然水体的融合来调配出试验所需要的饱和度为100%、110%、120%、130%、140%的气体过饱和水体。

图1 气体过饱和水发生装置Fig.1 Schematic representation of the generator of gas-supersaturated water

气体过饱和实验装置由控温系统和实验桶(半径0.4 m，长1.2 m)两部分组成。该装置能确保试验期间实验桶内的水温昼夜温差不超过±0.5℃，水体中气体饱和度偏差不超过±1%/4 h。溶解氧浓度使用美国哈希公司生产的HQ30D测定仪检测，其量程为0～200%，其精度为±1%。气体饱和度由丹麦Oxyguard公司生产的Handy Polaris TGP(Total Dissolved Gas Pressure)测定仪检测，其量程为0～200%，精度为±1%。

1.3 不同阶段草鱼和鲢在气体过饱和水中的暴露实验

1.3.1 草鱼和鲢受精卵暴露实验

挑选发育至原肠中晚期的草鱼、鲢受精卵分别放进自制可透水的金属桶(直径15.0 cm×高16.5 cm，小孔直径0.1 cm)，每桶放实验鱼卵各20粒，然后将金属桶放入气体饱和度100%、110%、120%、130%、140%的实验桶中。金属桶位于水面下5.0 cm处。每个饱和度设3组平行，对照组的实验鱼受精卵放入装有井水的实验桶内。实验过程中每隔4 h测量并记录实验桶内的水温和气体饱和度，控制草鱼和鲢受精卵最适孵化温度在(24.5±0.5)℃，并调节实验桶内气体饱和度以满足实验条件。记录桶内实验鱼受精卵的死亡情况，并通过解剖镜观察实验鱼受精卵的状态以及发育情况。当对照组完全出膜时，停止实验，记录各组卵未出膜数，统计孵化率。

1.3.2 草鱼和鲢仔鱼暴露实验

将草鱼和鲢仔鱼各30尾分别放进自制可透水的塑料网盒(长6.0 cm×宽4.0 cm×高8.0 cm，网目40)，然后将塑料网盒放入气体饱和度100%、110%、120%、130%、140%的实验桶中，对照组的实验鱼放入装有井水的实验桶内。塑料网盒位于水面下5.0 cm处，每个实验组设置3组平行。实验过程中每4 h测量并记录实验桶内的水温和气体饱和度，控制草鱼和鲢仔鱼最适生存温度在(24.0±1.0) ℃，同时调节实验桶内气体饱和度以满足实验条件。实验过程中记录桶内实验鱼仔鱼的死亡数量，并通过解剖镜观察刚死亡的实验鱼仔鱼受气体过饱和水影响的表观特征。

1.3.3 草鱼和鲢幼鱼暴露实验

将草鱼幼鱼15尾、鲢幼鱼20尾分别放进金属桶(直径16.5 cm ×高18.0 cm，小孔直径0.4 cm)内，然后将金属桶放入气体饱和度100%、110%、120%、130%、140%的实验桶中，对照组的实验鱼幼鱼放入装有井水的实验桶内。金属桶位于水面下5.0 cm处，每个实验组设置3组平行。实验过程中每4 h测量并记录实验桶内的水温和气体饱和度，控制草鱼和鲢幼鱼最适生存温度在(24.0±1.0) ℃，同时调节实验桶内气体饱和度以满足实验条件。实验过程中记录桶内实验鱼幼鱼的死亡数量，并通过解剖镜观察刚死亡的实验鱼幼鱼鱼体受气体过饱和水体的影响特征。

1.4 数据分析

用EXCEL2016计算实验鱼在不同饱和度的死亡率的平均值和标准差，并将计算结果导入GraphPad Prism 8中作图，以气体饱和度的值作为自变量，建立气体过饱和水体对实验鱼的饱和度-反应(死亡率)和时间-反应(死亡率)关系。本实验通过半致死时间LT50来表明不同饱和度的气体过饱和水体对草鱼仔鱼和幼鱼的影响，LT50越小，说明对实验鱼的致死效应越强，鱼类存活时间越短。将死亡率换成概率单位，同时对暴露时间进行对数处理，用Excel 2016计算暴露时间和反应(死亡概率)之间的线性关系式，其回归模型为y=Ax+B，其中A、B均为常数，当死亡概率达到0.5时得到的暴露时间即为半致死时间LT50。

2 结果与分析

2.1 气体过饱和水体对草鱼、鲢受精卵孵化的影响

通过不同饱和度的气体过饱和水体对草鱼、鲢这两种鱼类受精卵孵化的影响，结果显示不同饱和度的气体过饱和度水体对实验鱼的受精卵孵化均未有明显影响，受精卵的出膜率均达到100%。通过显微镜每4 h观察不同饱和度的过饱和水体的受精卵的发育情况，每个时间点观察实验鱼受精卵发育情况并未受到气体过饱和水体的影响，而且各饱和度下受精卵出膜的时间与对照并无明显的差异，各饱和度下均有个别受精卵表面附着一些气泡，但未影响实验鱼受精卵的发育情况，且实验鱼受精卵内未发现有气泡。

2.2 气体过饱和水体对草鱼、鲢仔鱼的影响

草鱼和鲢的仔鱼在气体过饱和度为100%、110%、120%、130%、140%水体的暴露实验结果如图2所示。图2A草鱼仔鱼的结果表明，各饱和度下，草鱼仔鱼在0～24 h的死亡率均增长较快，24 h后死亡率增长较为缓慢，56 h后死亡率增长趋于平缓。其中饱和度140%的气体过饱和水体下实验鱼的死亡率增长明显较其他各实验组快，且饱和度100%、110%、120%和130%的气体过饱和水体下实验鱼的死亡率随时间变化的趋势基本一致，其中饱和度140%的实验鱼最终死亡率最高达56.67%。图2B鲢仔鱼的结果表明，各饱和度下，鲢仔鱼在96 h后死亡率均较低，其中气体过饱和度为130%的实验鱼在88 h时死亡率达到最大的23%，而饱和度为100%的实验鱼基本没有影响。实验结果表明，各实验组中草鱼仔鱼的死亡率均高于鲢仔鱼。通过观察，气体过饱和水体下草鱼和鲢仔鱼主要表现为腹部肿胀有气泡导致其游动异常，最终腹部朝上浮于水面。用解剖镜观察死亡实验鱼主要是腹腔和其他部位肿胀充气(图3)。

图2 草鱼(A)和鲢(B)仔鱼在气体过饱和水体里暴露时间和死亡率关系Fig.2 Relationship between exposure time and mortality of larvae of C.idella(A) and H.molitrix(B) in gas-supersaturated water

图3 气体过饱和对草鱼(A)和鲢(B)仔鱼表观特征的影响(黑色箭头标示气泡位置)Fig.3 Effects of gas supersaturation on the apparent characteristics of larvae of C.idella(A) andH.molitrix(B)(black arrows indicate the position of bubbles)

2.3 气体过饱和水体对草鱼、鲢幼鱼的影响

草鱼和鲢的幼鱼在气体过饱和度为100%、110%、120%、130%、140%水体的暴露实验结果如图4所示。图4A草鱼幼鱼的实验结果表明，各气体饱和度下，草鱼幼鱼的死亡率有明显的变化趋势。其中气体饱和度140%的实验鱼在0～24 h死亡率急剧增长，32 h前后死亡率达到100%；气体饱和度130%的实验鱼在0～24 h死亡率急剧增长，24 h后死亡率增长变缓慢，56 h时死亡率达到最大值100%；气体饱和度120%的实验鱼在40～48 h之间死亡率急剧增长，48 h后死亡率较慢增长直至96 h；气体饱和度110%的实验鱼在64 h左右开始死亡，72 h后死亡率增长较快，直至96 h死亡率达60%；气体饱和度100%的水体对实验鱼基本没有什么影响，直至96 h三个平行组均只有一尾实验鱼死亡。图4B鲢的实验结果表明，各饱和度水体下，鲢幼鱼死亡率在实验过程中均缓慢增长，其中气体饱和度140%的实验鱼死亡率增长较其他实验组快，96 h死亡率达到最大值35%；气体饱和度100%的实验鱼受到影响较小；其他饱和度的实验鱼死亡率均较低。实验结果表明，气体过饱和水体中，草鱼幼鱼的死亡率高于鲢幼鱼。气体过饱和水体对草鱼和鲢幼鱼的表观影响主要是头部、腹部肿胀充气，鳍条充血有气泡，腹腔肿胀有气泡，肠道充气，血管有气泡形成血栓(图5)。

图4 草鱼(A)和鲢(B)幼鱼在气体过饱和水体里暴露时间和死亡率关系Fig.4 Relationship between exposure time and mortality of juveniles of C.idella(A) and H.molitrix(B) in gas-supersaturated water

图5 气体过饱和对草鱼(A)和鲢(B)幼鱼表观特征的影响(黑色箭头标示气泡位置)Fig.5 Effects of gas supersaturation on the apparent characteristics of juveniles of C.idella(A)and H.molitrix(B)(black arrows indicate the position of bubbles)a：头部；b：肠道；c：血管；d：胸腔

2.4 不同气体过饱和度下草鱼幼鱼的半致死时间

鲢仔幼鱼和气体饱和度100%的草鱼幼鱼在实验过程中死亡率均未到达50%，因此未计算其半致死时间。通过计算得出在不同气体饱和度的水体中草鱼幼鱼的半致死时间，结果如表1所示。气体饱和度110%、120%、130%和140%下，草鱼幼鱼的平均半致死时间分别为96.38、56.17、20.21和11.24 h，结果表明半致死时间随饱和度的增加而减少，说明气体饱和度越高对草鱼幼鱼的致死效果越强，实验鱼的存活时间越短。

表1 不同气体饱和度下草鱼幼鱼的半致死时间Tab.1 LT50 for C.idella juveniles at different level of gas supersaturations

3 讨论

水体里充足的氧气是鱼类受精卵孵化的重要条件，本实验结果表明气体过饱和水对草鱼和鲢的受精卵的胚胎发育和孵化均未造成影响。Marsh等[15]和其他气体过饱和的研究中均未发现对鱼类受精卵的孵化有任何影响，Arntzen等[16]也发现大马哈鱼受精卵对气体过饱和水体有较强的耐受力。然而有研究表明气体过饱和水体会促进鱼类受精卵的孵化[17,18]，或者增加鱼类受精卵死亡率[19]。杨川顺[17]在研究中指出气体过饱和水体里的受精卵周围会附着气泡，这些气泡导致鱼卵与水体里的氧气隔绝，从而形成低氧的环境。适当低氧含量的水体能促进鱼类受精卵的发育和孵化[18,20]，而严重低氧会导致受精卵死亡[21,22]。本实验过程中，草鱼和鲢受精卵基本没有气泡附着，而且实验组和对照组的实验鱼受精卵的胚胎发育和出膜时间没有明显差异，因此实验鱼受精卵的孵化未受到明显影响。Gale等[23]发现将大马哈鱼的受精卵暴露于高气体饱和度的水体中，鱼卵的重量和直径未受到影响，而且鱼卵的死亡率和气体过饱和水体之间未观察到有明显关系。通过本实验和上述相关文献表明，气体过饱和水体对鱼类受精卵的孵化可能没有直接影响，但不排除由于水体气泡过多导致受精卵周围环境的变化从而影响到受精卵的孵化。

草鱼、鲢的仔鱼和幼鱼的暴露实验结果表明，气体过饱和水体下，仔鱼的耐受力较幼鱼高。Bohl[24]将不同生长时期的虹鳟暴露于气体过饱和水体中，研究表明气体过饱和水体下鱼类的耐受力随着年龄的增长而下降，这与本实验的结论一致。机体在生命活动中需要不断地消耗能量，因此机体需要不断地从外界吸取氧，并将二氧化碳及时排出体内，这种吸收和排出气体的过程称为呼吸。鱼类的呼吸器官主要是鳃，但仔鱼在鳃器官未发育完全前，主要是借鳍褶及卵黄囊上的微血管网进行呼吸[25]。这些器官对氧气过饱和的敏感性不及鳃器官，气泡主要是通过吞食进入鱼体内在腹腔积累。而幼鱼心血管发育基本成型，气体通过呼吸作用进入机体血管，通过积累形成血栓阻碍血液流通，从而影响鱼体正常的生命活动，因此气体过饱和对实验鱼幼鱼机体的损伤程度高于仔鱼。

图2和图4结果表明不同气体过饱和度水体下，饱和度越高实验鱼的耐受性越低，但实验鱼的仔鱼在各饱和度的耐受性差异不是很明显。通过对草鱼幼鱼半致死时间的计算结果可以看出，饱和度越高的水体对实验鱼的致死效应越强。气体饱和度越高水体里气泡含量越多。过多的气体附着在体表和鳃丝上通过气体交换进入血管，在血管内积累形成血栓，从而阻碍血液循环导致鱼类死亡。水体气泡含量越高，幼鱼将气泡当作饵料吞食的机率越大，在肠道内积累的也越多。肠道内未能及时排出机体外的气泡，通过肠道壁渗透到腹腔。腹腔内气体堆积导致鱼体失去平衡腹部向上浮于水面，进一步加剧实验鱼的死亡。Weitkamp等[26,27]发现幼鱼的肠道内或口腔中的气泡会导致实验鱼腹部向上浮于水面，并且出现游动异常不规律的现象。董晓煜等[28]发现鱼体内溶解气体的升高会抑制血红蛋白的表达，溶解气体越高血红蛋白的表达量越低。本实验中随着水体气体过饱和度的升高，可能导致实验鱼的血红蛋白表达量降低，从而使血液里的氧气未能及时消耗同时二氧化碳未及时排出，致使这些气体在血管内积累加剧形成血栓，最终导致鱼类死亡。Alderdice等[29]和Jensen等[30]研究报道高饱和度的气体过饱和水体的鱼死亡时间较快，而低饱和度的鱼死亡时间则较慢。黄翔等[31]研究也表明鱼类死亡率随着气体过饱和度的上升而增加。上述研究表明，气体过饱和度越高，鱼体血管中血栓的形成越快，死亡速度则越快。

实验研究结果表明，气体过饱和水体下，鲢的耐受性较草鱼强。其可能原因是，鲢是滤食性鱼类，主要靠味觉进行摄食，而草鱼是草食性鱼类，主要靠视觉进行摄食[32]，因此草鱼可能更易于将水体里的微小气泡误当作食物吞入体内，导致肠道内气泡堆积。相同体长下鲢肠长远大于草鱼[33]，鲢肠道对气体的承载力可能要强于草鱼，在草鱼肠道内堆积的气体更易于扩散至腹腔内，从而导致鱼体失去平衡，腹部朝上浮于水面。草鱼肠道内的绒毛发达，吸收能力强，而鲢肠道内绒毛粗短且粘液细胞小，吸收能力较弱[33]，因此草鱼可能更易于将肠道内的气体吸收进入血液，导致过量气体在血管中堆积形成气栓从而加速鱼类死亡。

气体过饱和水体对不同鱼类的致死效应存在差异。将不同饱和度下，草鱼与长江其他几种鱼的半致死时间进行比较，结果如表2所示。

表2 各气体饱和度下不同鱼类的半致死时间Tab.2 LT50 for different species at different level of gas supersaturations

结果表明草鱼相较于其他几种鱼对气体过饱和有较强的耐受性，并且高饱和度的水体对鱼类有较强致死效应。本学科组野外观测发现在泄洪期间三峡大坝下游气体饱和度可达110%～140%，本研究结果表明长期暴露于此环境下会导致鱼类死亡。而随着金沙江和长江上游流域更多高体大坝的建成，水体中气体过饱和问题会更加严重。因此，亟待更多的相关研究，并以这些研究结果为基础制定相关法规政策以减轻甚至消除水体中气体过饱和对鱼类繁殖以及生长发育的影响。