酵母菌及其衍生物抗菌功能研究进展

发表时间:2024/04/01 00:00:51  浏览次数:3638  
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食源性致病微生物的污染是造成食源性疾病频发的重要原因之一,严重威胁着人们的身体健康和生命安全。食品工业中通常应用一些理化抗菌技术抑制食品中有害微生物的生长繁殖。然而这种抗菌处理可能会对食品品质造成不可逆的负面影响。近年来,利用天然温和的生物防控方法控制食品中有害微生物污染引起了广泛关注。拮抗酵母菌具有来源广泛、适应性和繁殖能力强、代谢产物无毒且无致敏性的特点,可以通过竞争营养物质和空间、分泌抗菌物质、寄生于病原菌及诱导宿主产生抗病性4 种主要的拮抗途径抑制多种有害微生物的生长,作为生防制剂已被广泛用于果蔬的采后保鲜。除了利用拮抗酵母菌的生物活性外,利用酵母菌的细胞结构特性,将一些化学抗菌剂包裹在失活的酵母菌细胞中也可以实现酵母菌的抗菌功能化。

上海理工大学健康科学与工程学院的马悦、单嘉宇、董庆利*等人在现有研究的基础上,从拮抗作用及搭载抗菌药两个方面归纳酵母菌的抗菌功能:在拮抗作用方面,总结讨论拮抗酵母菌的种类、来源、与其他抗菌技术的联合抗菌效果及其拮抗的机制;同时分析酵母菌作为天然载体搭载多种化学抗菌剂的优势及局限性。此外,展望未来酵母菌在抗菌领域的重点研究方向,旨在为以酵母菌为基础的新型抗菌剂的开发提供参考,以期更好地提高食品质量,保障食品安全。

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拮抗酵母菌的来源及种类

拮抗酵母菌广泛存在于果实表面、叶片、根部、土壤和海水等多种自然环境中,可通过离体/体外(in vitro)或活体/体内(in vivo)筛选两类方法实现拮抗酵母菌的筛选与分离。其中,体外筛选是指在配制的培养基上,将潜在的拮抗酵母菌和对其敏感的植物病原菌共同培养。孵育特定时间后,通过检测敏感植物病原菌的存活率,评价相应酵母菌的拮抗活性。体内筛选则是以真实果蔬基质作为两者的共培养基质,通过计算果蔬的患病率来评价相应酵母菌的拮抗活性。体外筛选的方法通常可针对单一敏感菌株同时筛选 多个潜在拮抗酵母菌。目前,国内外研究者已经通过上述两类方法成功地筛选分离出了多种不同来源的拮抗酵母菌。

如表1所示,体内筛选的方式可以同时监测酵母菌对病菌的抑制作用及其对食品基质理化性质的影响,现已成为拮抗酵母菌的主要筛选途径。然而,该方法相较于体外筛选通常需要更长的筛选周期,导致筛选效率较低。未来可以将体内外筛选方法结合,通过体外筛选的方法,针对同一敏感菌同时筛选多种潜在拮抗酵母菌,再进行二次体内筛选,评价其在真实食品基质上的拮抗效率,提高拮抗酵母菌的筛选效率。

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拮抗酵母菌的抗菌作用

2.1 单一拮抗酵母菌抗菌作用

表2总结了几种典型的拮抗酵母菌对特定致病菌或致腐菌的抑制效果。虽然抗菌效果因拮抗酵母菌的代谢活性、生命周期、繁殖能力及外部环境的不同而有所区别,但总体而言,单一酵母菌的抑菌谱较窄且拮抗效率有待提高,因此,商业化的酵母菌拮抗剂通常是多种拮抗酵母菌的组合,或与物理化学抗菌手段相结合,以满足实际应用中对广谱高效抗菌功能的需求。

2.2 多种拮抗酵母菌联合抗菌作用

单一拮抗酵母菌的抗菌谱较窄且容易引发有害微生物耐药。联合多种拮抗酵母菌可望拓宽抗菌谱并提高整体抗菌效率,由此减少酵母菌拮抗剂的使用量和使用频率,抑制有害微生物耐药的发生。然而不同种拮抗酵母菌之间的相容性可能影响它们联合使用时的拮抗效果。这可能是因为不同种类拮抗酵母菌之间存在对营养和空间的竞争关系,导致其对植物病原菌的抗菌活性总体降低。

2.3 拮抗酵母菌联合物理抗菌方法

物理手段控制有害微生物的生长繁殖是食品领域中常用的抗菌方法。然而长时间、高强度的物理抗菌处理可能影响食品质地和风味。将其与拮抗酵母菌联合使用有望提高抗菌效率,从而减少食品在苛刻物理抗菌环境下的处理时间及强度,降低食品质量及风味损失。此外,联合作用后有效提高了系统内苯丙氨酸解氨酶、多酚氧化酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶的活性,促进了抗菌活性物质的合成。当其与高强度的物理抗菌手段同时联用时,有可能造成自身菌体的损伤失活,丧失拮抗功能。

2.4 拮抗酵母菌联合化学抗菌方法

将拮抗酵母菌与化学物质联用是提高其抗菌效率的另一策略。根据所应用的化学试剂的类别可将其分为抗菌化学药剂、金属盐以及植物激素。表3总结了典型的拮抗酵母菌与各类化学物质联用后,针对特定植物病原菌的协同抗菌效果。不同种类的化学制剂与拮抗酵母菌之间的协同抗菌机制有所不同。

拮抗酵母菌与化学物质的联合使用因其低成本、高效率的特点已经成为食品工业中应用最为广泛的抗菌策略之一。已有研究表明,在保证相同杀菌效果的前提下,添加拮抗酵母菌可降低化学抗菌物质的投放剂量,从而降低有害微生物对相应化学制剂的耐药性,为此后拮抗酵母菌生防制剂的商业化推广提供了新思路。然而,化学制剂也可能对拮抗酵母菌的抗菌活性带来负面影响。因此,有必要系统性地量化化学制剂与酵母菌之间的相互作用,为优化抗菌剂配比提供科学依据。

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拮抗酵母菌抗菌作用机制

如图1所示,拮抗酵母菌的抗菌机制可分为4 个主要路径:1)与病原菌竞争营养物质及空间;2)分泌抗菌物质;3)直接寄生在病原菌菌丝上;4)诱导宿主产生抗病性。

3.1 与病原菌的竞争作用

拮抗酵母菌与植物病原菌竞争有限的空间和营养是实现其生防作用最主要的机制之一。相较于典型的植物致病菌,拮抗酵母菌具有适应能力强、繁殖迅速等特点,使其可以在短时间内迅速抢占果蔬伤口处的营养与空间,由此抑制植物病原菌的生长繁殖,实现果蔬的采后保鲜。

3.1.1 竞争营养物质

可以根据营养物质的种类将拮抗酵母菌和植物病源菌对营养物质的竞争分为碳源营养物、氮源营养物和金属离子。相较于碳源和氮源营养物质,参与细胞内酶代谢及合成的金属离子在食品基质中的含量较少,是拮抗酵母菌与植物病原微生物竞争的主要营养对象。拮抗酵母菌所产生的异羟肟酸盐类物质中,N-羟基及羰基氧原子均可以作为三价铁离子(Fe 3+ )的配体,与其形成稳定的铁离子复合物,从而减少同一营养体系下植物致病菌对Fe 3+ 的获取。典型的铁载体结构如图2所示。然而,一些有害微生物也可产生铁载体,与同一营养体系下的拮抗酵母菌竞争铁离子。

除金属离子外,对碳源和氮源营养物质的竞争也是拮抗酵母菌抑制有害微生物的重要拮抗途径。然而在含糖量较高的果蔬体系中,果实中所富含的D-葡萄糖、D-果糖和蔗糖等可以同时为拮抗酵母菌及病原体提供足量的碳源营养。此时对碳源营养的竞争不太可能发挥重要作用。除了碳源营养外,果蔬中含有的氨基酸、胺类、多肽、蛋白质和核酸是微生物生长繁殖所需氮源营养物的主要来源。

3.1.2 竞争生存空间

微生物的生长繁殖除了对营养物质的需求外,还需要一定的生存空间。对生存空间的竞争是酵母菌抑制植物病原菌的另一个关键拮抗途径。在真实食品基质中,可用的定植空间十分有限,一些拮抗酵母菌通过在伤口处迅速繁殖并形成生物被膜占据有限的生存空间,从而抑制其他有害微生物的繁殖。有些可以生成生物被膜的酵母菌,在定植过程中会转化为菌丝形式,攻击宿主细胞,即使在没有植物病原菌的条件下仍会导致采后果蔬的病变。

3.2 分泌抗菌物质

拮抗酵母菌可能通过分泌抗菌物质抑制植物病原体的生长繁殖。根据抗菌物质的化学结构可将其分为嗜杀毒素、裂解酶类和挥发性VOCs。

3.2.1 嗜杀毒素

某些酵母菌具有嗜杀活性,即能分泌蛋白质类的杀手毒素杀死其他菌株,而其自身则对杀手毒素具有免疫力。通常嗜杀酵母菌所分泌的杀手毒素被糖基化后会与目标微生物细胞壁上的一级受体(β-1,3-D-葡聚糖、β-1,6-D-葡聚糖、β-1,3-甘露糖蛋白和几丁质)结合。随后被转运到细胞质膜上,与二级受体结合并最终通过水解细胞壁、破坏细胞膜、阻断细胞周期、攻击tRNA、破坏DNA或阻断钙的摄取,导致敏感病原体失活。

针对嗜杀毒素未来的研究方向可以分为3 类:1)合成机制及受体结构探究。除酿酒酵母菌外,膜醭毕赤酵母菌,土星拟威尔酵母菌(Williopsis saturnus)、威客汉姆酵母菌(Wickerhamomyces anomalus)和乳酸克鲁维酵母菌(Kluyveromyces lactis)等其他嗜杀酵母菌的嗜杀毒素的合成路线及其受体结构的研究较为罕见,有待进一步完善。2)嗜杀毒素的活性评估。绝大多数嗜杀毒素的化学本质是蛋白质,受pH值、温度和水分活度等环境因素的影响较大。因此嗜杀酵母菌应用于真实食品基质时,应该系统评估不同食品基质及加工环境对嗜杀酵母菌所产生的嗜杀毒素活性的影响。3)嗜杀毒素的靶向改性。除有害微生物外,一些益生菌或拮抗酵母菌的细胞结构中也具有嗜杀毒素的结合受体,因此可能被嗜杀毒素灭活。对此可以通过基因工程或者化学修饰技术,赋予嗜杀毒素针对有害微生物的靶向特性,提高对有害微生物的防控效率。

3.2.2 裂解酶类

几丁质、葡聚糖和蛋白质是组成微生物细胞的重要组成成分,某些拮抗酵母菌可以通过分泌相应的裂解酶破坏特定微生物的细胞结构,从而抑制其生长繁殖。

根据几丁质酶作用时的切割位点,可以将其分为内切酶和外切酶两大类。其中内切酶可以作用于几丁质中的β-1,4糖苷键,在几丁质长链中随机切割,形成二乙酰壳二糖及低分子壳寡糖。外切几丁质酶再细分为两类:催化几丁质从非还原性末端释放二乙酰壳二糖的外切几丁质水解酶以及可以分解低分子壳寡糖,生成N-乙酰葡萄糖胺的N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶。与几丁质酶相似,葡聚糖酶通过破坏β-1,4糖苷键裂解有害微生物细胞结构中的葡聚糖致其死亡。同理,葡聚糖酶也可以分为内切酶和外切酶两类。前者是在葡聚糖的随机位点水解β-1,4糖苷键,生成聚合度较小的寡糖及单体葡萄糖,而后者则是从葡聚糖的非还原端依次切割葡萄糖单元的残基,破坏葡聚糖结构,实现葡聚糖的结构裂解。然而上调或下调拮抗酵母菌中编码该葡聚糖酶的基因虽然能够影响酶的表达量,但是对其抗菌效果影响甚微。这可能是由于细胞膜结构中葡聚糖层外部的酵母菌甘露糖蛋白的空间阻隔效应,使得只有少量的葡聚糖酶进入葡聚糖层催化水解反应。

某些拮抗酵母菌可以分泌蛋白酶,通过催化有害微生物中蛋白质分子的酰胺键水解实现对其生长繁殖的控制。根据催化位点的特性和作用条件的不同,将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶4 类。将该拮抗酵母菌中控制碱性丝氨酸蛋白酶的相关基因整合到大肠杆菌BL21后,大肠杆菌也可以有效抑制相关植物致病菌的生长,充分证明了拮抗酵母菌分泌的蛋白酶是其实现抗菌功能的重要途径之一。

3.2.3 挥发性有机化合物

VOCs是由某些拮抗酵母菌在其代谢过程中产生的具有一定抗菌活性的醇类、酯类等小分子物质(分子质量小于300 Da)。然而在实际情况下,拮抗酵母菌可以产生多种VOCs协同抑制病菌生长繁殖。因此,纯化后的单一VOC对特定病原菌的体外抑制效果不能直接反应该拮抗酵母菌在真实食品基质中的拮抗效果。

拮抗酵母菌的衍生物VOCs有望作为一种新的生防制剂应用于果蔬采后病原菌的控制。当VOCs用作生防剂时,通常需要在密闭的条件下才能维持足够高的浓度实现有效的抑菌活性。然而,果蔬的呼吸作用会迅速消耗掉该密闭环境中的氧气,迫使果蔬细胞进行无氧呼吸,将果蔬中的糖和有机酸等营养物质分解成乙醇和乙醛等不完全氧化产物,对果蔬的感官特性造成负面影响,降低食品质量。对此,可以在密闭体系中充入大量氧气来避免无氧呼吸,然而果蔬在有氧呼吸条件下可能释放大量的热能,导致果蔬附近的温度上升,增加病菌的繁殖活性,降低VOCs的抗菌效率。原位富集拮抗酵母菌产生的抗菌VOCs是突破此类生物防治剂应用限制的关键。

3.3 直接寄生作用

直接的寄生效应是指拮抗酵母菌依附在病原菌的菌丝结构中,通过从病原菌细胞中汲取营养或释放相关裂解酶破坏病原菌细胞结构,抑制其生长繁殖,从而减少由病原菌感染而引发的果蔬采后病变,提高果蔬质量。

3.4 诱导寄主产生抗病性

果蔬植物具有先天免疫系统,可识别并响应病原菌的存在,但如果该响应效果不足,植物就可能被植物病原菌侵害,加速病变腐败。某些拮抗酵母菌能够强化植物宿主对病原菌的响应,诱导宿主通过一系列的超敏反应(HR)生成与致病相关的蛋白(PR)、裂解酶、抗氧化酶和植物抗毒素等物质抑制植物病原菌的生长繁殖,减少果蔬的真菌病变,从而提高食品质量。然而,有研究发现,即使是失活的酵母菌也可以上调宿主PR蛋白相关基因的表达,刺激PR蛋白的分泌,抑制扩展青霉在宿主上的繁殖。显然,PR蛋白在宿主抗病机制中发挥着重要的作用,但是酵母菌细胞如何介导宿主调控PR蛋白相关基因的分子机制尚未可知。

除PR蛋白外,拮抗酵母菌也可诱导宿主提高多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)等多种抗氧化酶的活性,增强宿主对由植物病原菌感染而引发的氧化应激反应的抗性。此外,一些酵母菌可以诱导宿主产生植物抗毒素,从而抑制植物病原体的污染。

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酵母菌微胶囊搭载抗菌剂

拮抗酵母菌的抗菌效率通常较低且抗菌谱相对较窄,难以满足特定应用场景下对快速、高效且广谱抗菌功能的需求。通过真空高压或化学水解法去除酵母菌内部的细胞器,可使之成为其他化学抗菌剂的天然载体,将其与不同种化学抗菌剂结合即可重新赋予酵母菌颗粒抗菌活性。相较于其他药物递送载体,酵母菌及其衍生微粒具有大小可控、成本低的优点。

4.1 酵母菌搭载氯基抗菌剂

常见的氯基抗菌剂有次氯酸钠(NaClO)、次氯酸(HClO)以及卤胺类。因其具有高效广谱的杀菌特性而被广泛应用于食品加工环节。然而氯基抗菌剂稳定性较差,在热或光照条件下容易水解从而失去抗菌活性。将氯基抗菌剂载入酵母菌微胶囊可有效提高其抗菌功能稳定性。

4.2 酵母菌搭载抗菌光敏剂

抗菌光敏剂通常具有共轭化学结构,通过吸收特定波长的光源,将光敏分子从基态激发至激发态后,再与氧气和水分反应生成多种具有抗菌活性的活性氧(ROS),从而实现抗菌功能。由于其独特的化学结构,抗菌光敏剂通常在水环境中的溶解度有限且与有害微生物间的亲和性较差,导致抗菌效率较低。因此,将光敏剂包裹在酵母菌微胶囊中,可提高抗菌颗粒整体的亲水性及与有害微生物间的亲和性,实现抗菌效率的提高。值得注意的是,封装后的光敏剂必须从酵母菌微胶囊中释放并暴露在特定波长光源后才能产生抗菌功能的ROS。过快释放可能导致大量光敏剂聚集在一起,短时间内产生的大量ROS相互猝灭,抗菌效率降低;而释放速率过慢可能只造成有害微生物的可逆损伤而非彻底杀灭。因此,实现光敏剂从酵母菌微胶囊体系中的可控释放是提高其抗菌效果的关键。

4.3 酵母菌搭载抗菌精油

相较于氯基及光敏抗菌剂,抗菌精油可从天然植物中提取,相对毒性较低,可作为添加剂应用在食品中。然而抗菌精油因稳定性差、挥发性和气味性强和有效剂量浓度高等问题限制了其应用范围。将抗菌精油搭载在酵母菌微胶囊中,可有效保护精油成分、遮掩气味且通过靶向递送提高目标范围内的精油浓度,在不影响食品质地的前提下,实现高效稳定且持久的抗菌效果。

抗菌精油是一种小分子混合物,其抗菌效果可能是多种活性成分共同作用的结果。在利用酵母菌封装抗菌精油时,不同化学结构的小分子与酵母菌微胶囊间的相互作用强度不同,可能导致缓释速度差异,使得协同抗菌的效率降低。

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结 语

致腐和致病的微生物污染食品可能会影响食品质量,造成食品安全隐患。利用某些酵母菌的拮抗作用或者载药功能可以抑制有害微生物在果蔬等食品基质中的生长繁殖,提高食品质量并保障食品安全。近年来,开发与酵母菌相关的抗菌制剂已经成为有害微生物防控领域的研究热点。本文在现有研究的基础上,从拮抗作用及载药抗菌两个方面,系统性地归纳总结酵母菌的抗菌功能。在拮抗作用方面,从拮抗酵母菌的种类、筛选方法、与其他抗菌技术的联合抗菌效果及其拮抗机制多个角度,总结与拮抗酵母菌相关的生防剂开发存在的主要问题及改进方向;在载药抗菌方面,分析酵母菌作为天然药物载体与多种化学抗菌剂组合的优势及局限性。

未来针对酵母菌抗菌功能的研究展望:第一,结合体外和体内酵母菌筛选方法的优势,提高拮抗酵母菌的筛选效率。首先通过体外筛选的方法,针对同一敏感菌同时筛选多种潜在拮抗酵母菌,从其中选择拮抗效果最佳的酵母菌株,再利用真实食品基质进行二次体内筛选,考察拮抗效果的同时评估拮抗酵母菌对食品基质的影响,提高拮抗酵母菌筛选效率。第二,从分子水平探讨拮抗酵母菌的作用机制。目前酵母菌拮抗机制的研究多止步于对所分泌的铁载体、裂解酶等抗菌化合物的检测,但在其产生过程中,酵母菌分子水平上的代谢机制尚不清晰。此外,不同种酵母菌在分子水平上的拮抗机制不尽相同,系统性地总结和归纳拮抗酵母菌在分子水平上的最新研究动态,能够进一步揭示拮抗酵母菌的拮抗机制并为基因工程改性高活性拮抗酵母菌提供科学参考。第三,实现载药酵母菌微胶囊的可控释放。首先定量评估酵母菌微胶囊与所搭载的化学抗菌剂两者间的相互作用,在此基础上通过对酵母菌细胞结构进行物化改性,实现载药酵母菌微胶囊的可控释放从而提高抗菌效率。以希望实现利用酵母菌及其衍生物的抗菌功能提高食品质量,保障食品安全。


本文来源于《食品科学》2023年44卷21期405-416页. 作者:马 悦,单嘉宇,蒋耀东,黄俊楠,王旭,张凌魁,杨朔,董庆利

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