水产动物病原药物敏感性实验技术

杨移斌1，艾晓辉1，宋 怿2

（1.湖北省武汉市东湖高新技术开发区武大园1路8号 中国水产科学研究院长江水产研究所  2.1001412，中国水产科学研究院，农业部水产品质量安全控制重点实验室）

随着水产养殖业的迅猛发展，高密度、集约化养殖虽然带来了水产品产量的不断攀升，但是同时也使得水产养殖动物的生存环境日渐恶化，从而导致各类疾病频发。病害发生导致重大经济损失的原因常常是没有做到准确诊断，没有做到对病用药，通常是凭经验进行诊断用药。因此有必要提高水产一线从业者进行病原分离，开展药物敏感性实验的意识，以做到准确诊断鱼病，对病用药。本文将就药物敏感性实验进行介绍及改良，从而更好地供同行参考及应用好药物敏感性实验。

1 药物敏感性实验使用范围

药物敏感性实验（简称药敏实验，）涉及到病原及药物两方面，因此病原必须是可体外培养的，可分离的，而药物目前常用抗生素都有市售药敏纸片供选择，而针对其他药物如消毒剂等，则可进行相应的MIC/MBC测定，从而评估病原对其敏感性。目前可以进行药敏实验的病原只有细菌、真菌以及一些寄生虫（寄生虫的药敏实验主要以活虫体在药物刺激下挣扎程度来反应的）。

2 药物敏感性实验操作

目前药敏实验主要分为琼脂扩散法（即K-B法）及倍比稀释法，而琼脂扩散法又分为打孔法及药敏纸片法。一般以药敏纸片法及倍比稀释法最常用。

无菌条件下，取患濒死水产养殖动物，取病灶及重要组织器官如肝肾脾等，用接种环蘸取所取各样品在固体培养基上划线，置于28℃恒温培养箱中培养24h。从已经长好菌落的平板上挑取形态大小、颜色相近的菌落进一步纯化培养。向分离得到的纯化菌株加入25%甘油，混匀后于-80℃冷冻保存。

药敏纸片法：将分离株接种于液体培养基中，经200r/min恒温28℃震荡培养18h，用无菌生理盐水调整分离株浓度为104-108CFU/mL，取100μL菌液均匀涂布于固体琼脂培养基上，贴上不同种类的药敏纸片，28℃恒温培养24h后测量抑菌直径，根据药敏纸片说明书或者其他标准判定分离株对不同药物的敏感性。

倍比稀释法：主要是通过使用液体培养基倍比稀释药物，然后在每个浓度药物内接种病原，恒温培养24h后，把无菌生长、稀释度最大的药物如消毒剂浓度作为分离株的MIC，取所有无菌生长的组涂布于固体培养基上，恒温培养24h后观察有无菌落生长，平板上无菌落生长的最低药物如消毒剂浓度即为MBC。

3 实际生产中可选用的药敏实验方法

在实际生产中由于条件限制以及病情的紧迫性，使得药敏实验不太可能像在实验室这么开展，因此制定生产中药敏实验方法显得更加迫切，下面就生产中可行的药敏实验方法进行详细阐述。

首先针对发病水产养殖动物进行取样，同样是选择具有典型症状濒死的个体。在无菌条件下，取其病灶部位及重要组织器官。将所取样品分别剪碎，溶解于无菌0.9%生理盐水中，后涂布于固体平板上，或者接种含有不同浓度药物试管中，其后操作同上，经恒温24h培养后即可读取结果。

4 小结

本文就传统药敏实验意义、适用范围及操作步骤进行了相关阐述，可以使水产一线从业者更好地认识及理解药敏实验，也是为其重视、甚至是践行药敏实验提供良好的技术材料。对药敏实验技术进行改良的意义在于第一节省了宝贵的时间，直接把病样碾碎，溶解于生理盐水中，伴随着把病原也溶于其中，从而不再需要纯化培养细菌，可节省近三天的时间；第二在于提高了药敏实验的准确性，在现今各种病害频发的年代，单一病原引发病害早已成为过去时，现在多是多种病原多重感染引发的，如黄颡鱼腹水病、中华鳖腐皮病等，笔者从事水生动物病害临床诊断多年，深有感触，好不容易将病样中微生物纯化分离出来，一看傻眼了，各种微生物呈现在眼前，而感染却很少有成功的，多次重复都很难奏效，用此种病纯化出来的微生物进行药敏实验，其效果就可想而知了，本方法采用不纯化病原，即使病原多样，涂布于或者接种于液体培养基上，微生物都可生长，而药物对其抑制或者杀灭，都是同步反应出来的，因此可以显著提高药敏实验效果。综上，药敏实验需好好做，但更应该做好，为养殖户谋福利，为水产养殖动物减轻痛苦。