150种中草药体外抑杀维氏气单胞菌的药效研究

朱成科，王 建，周 燕，雷 骆，邓星星，蒲德成，郑宗林，周朝伟，郑永华

(1.西南大学荣昌校区水产系，淡水鱼类资源与生殖发育教育部重点实验室， 水产科学重庆市市级重点实验室，重庆 402460；2.巫溪县农业委员会，重庆 405899； 3.西南大学动物科技学院，重庆 400716)

维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)隶属于气单胞菌科(Aeromondaceae)气单胞菌属(Aeromonas)的一种条件致病菌，广泛存在于淡水、海水、淤泥和土壤中[1]，在繁殖过程中产生黏附素、细胞毒素、肠毒素、气溶素和溶血素等毒力因子，对水产动物、畜禽和人都有较高的致病性，为一种典型的人—兽—鱼共患病病原菌[2]。常引起虾、蟹、蚌、鱼、蛙和鳖等水生生物细菌性败血症、体表出血、腐皮病、烂尾病等多种疾病[3-5]，该菌引发的疾病具有发病快、死亡率高的特点，给水产养殖带来巨大的损失。

目前，尽管已有维氏气单胞菌灭活疫苗研究报道，但受病原菌血清型、免疫方式、鱼体自身特点等因素制约，致使免疫效果较差或不稳定[6,7]。因此，现在对于水产养殖动物细菌性疾病大多仍采用抗生素和合成药物来控制其发生和流行[8]，然而大量、长期使用容易导致病原菌出现耐药性增强，同时对水生态环境以及药物残留引起的水产品质量安全等负面影响备受人们关注[9]。所以急需寻找一种安全高效的新型水产药物用于维氏气单胞菌病的防治。

中草药种类丰富，分布广泛，在治疗人类和动物疾病方面具有悠久的历史，抑杀菌效果明显[10]。与抗生素相比，中草药具有无残留、无抗药性、毒副作用弱、对环境不易造成污染的特点[11]，同时，中草药还具有免疫调节、补充营养和提高生产性能等作用，符合绿色健康养殖的要求[3,12]。选取150种具有广谱抗菌活性的中草药，研究其提取物对维氏气单胞菌的体外抑菌作用，以期在实践中筛选出对其体外抑制作用较好的中草药，为该菌引起的水产动物疾病提供科学用药的依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试维氏气单胞菌株RC110724(登录号：KC663719)由西南大学荣昌校区水产系鱼类繁育与健康养殖研究中心从患病黄颡鱼的肝、脾等内脏组织中分离、鉴定[1]，于4 ℃冰箱保存备用；150种中草药(表1)均购买于重庆市荣昌区东风大药房。

试验用普通肉汤液体培养基配方为：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，氯化钠5 g，水1 000 mL，pH值调至7.2～7.4，121℃灭菌15 min。固体培养基为每1000 mL液体培养基加入15 g琼脂粉。

1.2 试验方法

1.2.1 菌液制备

将维氏气单胞菌菌株RC110724接种于液体培养基中，28 ℃震荡(200 r/min)培养4～6 h，取200 μL菌液均匀涂布于固体培养基，28 ℃培养4 h，在药效试验开始前，无菌蒸馏水洗下菌苔，采用麦氏比浊法将菌液浓度稀释至1×107CFU/mL，待用。

1.2.2 中草药药液的制备

150种中草药除大蒜外放入60 ℃干燥6 h后各取20.0 g，以400 mL蒸馏水浸泡2 h后煎煮，煮沸后文火煎煮30 min，4层纱布过滤，残渣再加入300 mL蒸馏水，煎煮2次，合并所得药液，浓缩至20 mL，使其终浓度为1.0 g/mL，调pH值至中性附近。121 ℃湿热灭菌15 min，4 ℃保存待用。大蒜提取如下：挑选完好的蒜瓣，去皮，按质量1:1加入蒸馏水，研磨成浆，100目筛绢网过滤，4 000 r/min离心5 min，取上清液保存于4 ℃冰箱中，当天用[13]。

1.2.3 药物体外抑菌试验

采用琼脂扩散法[14]测定。取稀释后的菌液200 μL均匀涂布于普通琼脂平皿(直径为9 cm)上，待菌液干后，用直径6 mm的灭菌打孔器在平皿上打4个孔，其中3孔加入50 μL药液，另一孔以灭菌蒸馏水为阴性对照。置于28 ℃培养，培养24 h后观察并测量抑菌圈直径的大小。参照文献[15]将中药划分成4个等级，分别为：抑菌圈直径大于20 mm为抑菌作用强，用“+++”表示；直径15～20 mm为中等强度抑菌作用，用“++”表示；10～15 mm表示抑菌作用弱，用“+”表示；小于10 mm为无抑菌作用，用“-”表示。

1.2.4 最低抑菌浓度(MIC)的测定

用二倍稀释法测定各药物的最低抑菌浓度(MIC)[11,16]。在超净工作台内，将中草药提取液加入无菌普通肉汤液体培养基中，至使中草药提取液终浓度分别为：1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.63、7.81、3.91、1.95、0.98、0.49、0 mg/mL，然后吸取上述各浓度梯度普通肉汤培养基2 mL于10 mL灭菌试管中，在每个试管中加入20 μL维氏气单胞菌菌液至终浓度为1.0×105CFU/mL。置于28 ℃、150 r/min恒温摇床中培养24 h。然后观察结果，清澈透明无浑浊现象的试管即为无菌生长管，无菌生长管中的最低药物浓度就是最小抑菌浓度(MIC)，每种药物重复3次。

1.2.5 最低杀菌浓度(MBC)的测定

在MIC试验基础上，把无菌生长的各管摇动均匀，继续培养24 h，观察结果，清澈透明无浑浊的无菌生长管中的最低药物浓度为最小杀菌浓度(MBC)。并进一步验证试验，分别吸取该管及上一浓度梯度管的培养液0.1 mL，涂布于相应的琼脂培养基上，28 ℃培养24 h，观察是否有菌生长，最小杀菌浓度管无菌落形成则表明前面判断正确，否则有误，需重新开展试验[17]。

2 结果与分析

2.1 150种中草药提取液的抑菌效果

150种中草药对维氏气单胞菌的体外抑菌活性试验结果见表1。对维氏气单胞菌作用强(+++)的中草药有五倍子、石榴皮、地榆和乌梅，抑菌圈直径分别为(20.89±0.31)mm、(20.82±0.48)mm、(20.65±0.51)mm和(20.08±0.05)mm。中等强度抑菌作用(++)的有虎杖、黄柏、香薷等16种中草药，抑菌直径为15～20 mm。木瓜、萹蓄、桉树叶等34种中草药提取液表现出弱抑菌作用(+)，抑菌直径为10～15 mm。海风藤、柴胡、茵陈等96种中草药提取物不敏感，抑菌直径均小于10 mm。

表1 中草药提取液对维氏气单胞菌的抑菌效果Tab.1 Antibacterial effect of Chinese herbal medicines on A.veronii

续表1

续表1

注：“+++”表示抑菌作用强，“++”表示抑菌作用中等，“+”表示抑菌作用弱，“-”表示无抑菌作用

2.2 MIC和MBC的测定结果

选取抑菌圈直径大于10 mm的中草药采用二倍稀释法测定药物对维氏气单胞菌的MIC和MBC，试验结果见表2。五倍子、地榆、石榴皮、乌梅、虎杖和诃子MIC和MBC均小于10 mg/mL，其中，五倍子抑菌作用和杀菌作用最强，MIC和MBC均为1.95 mg/mL，其次为地榆，其MIC为1.95 mg/mL，MBC为3.91 mg/mL；五味子、仙鹤草、香薷等13种中草药具有较强的抑菌作用和杀菌作用，MIC和MBC介于15.63 ～62.50 mg/mL之间；艾叶、香加皮、女贞子等18种中草药具有一定的抑菌作用和杀菌作用，MIC和MBC在125.00 ～250.00 mg/mL之间；刘寄奴、秦皮、穿心莲等17种中草药没有表现出明显的抑菌作用和杀菌作用，MIC和MBC均大于250 mg/mL。

表2 中草药提取液对维氏气单胞菌的最低抑菌浓度和最小杀菌浓度Tab.2 MIC and MBC of Chinese herbal medicines on A.veronii mg/mL

续表2

3 结论

采用打孔法(琼脂扩散法)和二倍稀释法从150种常见具有抗菌、清热解毒特性的中草药中筛选出五倍子、地榆、石榴皮、乌梅、虎杖和诃子对维氏气单胞菌表现出了明显的体外抑菌和杀菌活性，MIC和MBC均小于10 mg/mL，表明五倍子等6种中草药对预防和治疗由维氏气单胞菌引起的水产动物疾病具有良好的应用前景。

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