12种中药及其组方对3种水产致病菌的抑菌作用

杨培奎，林 敏，张振霞，查广才，郑玉忠

(韩山师范学院生命科学与食品工程学院，广东潮州 521041)

目前，水产疾病的发生和流行已严重威胁到软体动物、鱼类、虾等的规模化养殖[1]。其中由嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)等引起的细菌性病害是水产养殖业面临的严重威胁之一[2-5]。面对水产动物疾病频发的情况，一些水产养殖企业大量使用或不规范使用抗生素，使得细菌耐药性频繁发生，加重了水产疾病防治的困难。这不仅危害水产养殖业的健康发展，而且也威胁到人类的健康，因此寻求抗生素替代品是水产养殖业的重要方向[3]。许多中药具有抗病毒、抗菌活性和增强免疫的特点，且来源广泛、价格低廉，毒性低，不易产生耐药性等。因此，在当前限制使用抗生素的形势下，使用中药提取物替代传统抗生素是水产养殖动物病害防控的发展趋势之一。本试验以嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌为致病菌的代表，进行体外抑菌试验筛选有效的中药抗菌药物，旨在为中药在水产养殖病害防控中的使用提供指导。

1 材料和方法

1.1 供试材料

所有中药材均购自康美药业有限公司，经珠海国家中医药现代化工程研究中心鉴定。为防止湿气和虫蛀，将中药材保存于4 ℃的干燥密封容器中。本研究选用测试菌株嗜水气单胞菌(NBRC 12658)、副溶血弧菌(ATCC 17802)和溶藻弧菌(ATCC 33787)均为汕头大学谢丽玲教授惠赠。

1.2 方法

1.2.1 中药药液的制备

称取中药25 g加入500 mL蒸馏水中，浸泡30 min，煮沸1 h，用纱布过滤，收集滤液，文火煎熬浓缩至25 mL相当于生药的质量浓度为1 g/mL；随后将滤液1 000 r/min离心10 min，收集上层滤液并用0.22 μm滤膜过滤；将滤液分装，取出一部分用于药液干物质质量测定，其余保存于-80 ℃备用。本研究所用中药及其提取液干物质质量浓度如表1所示。

表1 试验中草药及其提取液质量浓度Tab.1 Tested Chinese herbal medicines and extracts matter concentration mg/mL

1.2.2 体外抑菌活性测定

采用圆盘扩散法测定所有中药提取物的抑菌活性。取少量保种菌株接种于LB液体培养基中，并在30 ℃，150 r/min恒温摇床中培养18 h。接着，吸取 1 mL 菌液于1.5 mL 离心管中，6 000 r/min离心2 min，弃去上清，用无菌生理盐水稀释菌体至 1×107CFU/mL，取100 μL细菌悬浊液涂于LB固体培养基上。随后，在LB固体培养基上放置直径为6 mm的灭菌滤纸，并用20 μL的中药提取液浸润。将培养皿置于30 ℃培养24 h，随后测定抑菌圈直径。以恩诺沙星(Sigma,20 μL,0.1 mg/mL)为阳性对照，以20 μL蒸馏水为阴性对照。所有的分析都进行了三次。计算平均值，进行对比研究，根据抑菌圈直径大小判定其抑菌能力的强弱。

1.2.3 测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)值

用肉汤微量稀释法测定中药提取物对供试菌株的MIC和 MBC。首先，准备12个无菌离心管，在第一个离心管中加入500 μL的中药提取物并与1.5 mL的LB液体培养基混合。随后，吸取1 mL以1∶1(1 mL的稀释中药提取液：1 mL的LB液体培养基)依次稀释到第2～11管，第12管作为空白对照。每管接种(20 μL)菌悬液(1×106CFU/mL)，所有试管30 ℃孵育24 h。 孵育后，每个试管中加入5 μL MTT(Sigma,5 mg/mL)溶液，30 ℃孵育30 min[6,7]。在有大量活菌存在的离心管中，黄色MTT染料被还原为蓝色，因此将培养基颜色未发生变化的最小药物浓度定为MIC，分析重复三次。从判定为MIC的离心管及高一级药物浓度的离心管中分别取部分液体培养基涂布于LB营养琼脂板上，30 ℃培养24 h，观察是否有菌落。未长出菌落的试管的最小药物浓度即为MBC，分析重复三次。

1.2.4 棋盘格法测定中药组合效果

依据朱利霞等[8]和龙继兵等[9]的方法，采用微量肉汤棋盘稀释法测定丁香、山茱萸、五味子、罗汉果、八角等5种中药两两组合后的体外抑菌的联用抑菌指数(FIC)。根据体外抑菌试验结果，选择5种体外抑菌效果敏感药物两两组合按照1∶1的比例进行配比，并测定联用抑菌指数(FIC)。

FIC(联用抑菌指数)的计算方法[8,9]如下：

∑FIC=FICA+FICB

式中FICA为A药联用时MIC值/A药单用时的MIC,FICB为B药联用时MIC值/B药单用时的MIC。当FIC≤0.50时,为显著协同作用；当0.50

2 结果

2.1 中药体外抑菌圈测定结果

从抑菌结果可知(表2)，12种中药提取液对3种供试致病菌均具有一定的抑制作用。其中，五味子、八角、罗汉果、山茱萸和丁香等对供试菌株的抑制作用明显优于其它中药。在12种中药中，五味子对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的抑制效果最好。另外，地黄提取物对副溶血弧菌和溶藻弧菌有抑制作用，对嗜水气单胞菌无抑制作用，黄芩提取物对嗜水气单胞菌和溶藻弧菌抑菌效果较弱，对副溶血弧菌抑菌效果较好。

2.2 单味中药MIC与MBC值测定结果

对中药提取液抑制嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC和MBC进行测定。结果表明，12种中药水提取物对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌均具有不同程度的抑菌或杀菌作用(表3)。12种中药提取液的MIC值为0.043～18.594 mg/mL，MBC值均为0.043～37.188 mg/mL。12种供测试的中药中，丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和黄连等对供试菌株的抑制效果优于其它中药。其中，山茱萸对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的MIC分别为0.172、0.043、0.086 mg/mL， MBC分别为0.344、0.043、0.172 mg/mL,是所有供试中药中最低的，显示该中药对上述3种病原菌具有良好的抑制作用。

表2 中药提取物的抑菌活性Tab.2 Antibacterial activity of herbal extracts measured as zones of inhibition

表3 中药提取物的MIC值和MBC值Tab.3 Minimum inhibitory concentration(MIC) and minimum bactericidal concentration(MBC) of extract against bacteria mg/mL

2.3 中药提取物的联合抑菌效果

在MIC和MBC分析的基础之上综合抑菌圈的测定结果，选取丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和八角等五种中药进行复方联合抑菌分析，结果如表4所示。结果表明，10种不同的药物组合对嗜水气单胞菌的联合抑菌作用均为显著协同作用；而大部分药物组合对副溶血弧菌的抑菌效果表现为无相关作用，仅五味子和八角对副溶血弧菌的组合效果表现为协同作用。另外，丁香和罗汉果对副溶血弧菌的组合效果表现为拮抗作用。10种中药组合对溶藻弧菌的联合抑菌效果均表现为协同作用。在上述测试的10种药物联合抑菌中，仅五味子和八角配伍组合对3种供试菌株的联合抑菌效果表现为显著协同作用或协同作用。

表4 中药提取物的联合抑菌效果Tab.4 Combination effects of herbal extracts for inhibiting bacteria

3 讨论

中药作为一种兼具经济型和广谱型的抗菌剂，近年来被作为促生长剂[11]、免疫兴奋剂[12]、抗菌药物[13]、抗病毒药物[14]、抗真菌药物[15]、抗应激药物[16]广泛应用于水产养殖业。中药抑菌常见的机制为中药有效成分通过与细菌细胞膜、细胞壁、酶等结合，导致细胞结构发生变化或者酶变性，以多靶点的方式抑制细菌的生长或杀死病原菌[17]。本研究发现在单药的抑菌圈分析中，五味子同时对3株供试菌株的抑菌效果最明显。类似的研究也表明，五味子是一种潜在广谱抗菌药，对多种病原菌如多杀性巴氏杆菌(Pasteurellamultocida)、河流弧菌(Vibriofluvialis)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)等具有较好的抑菌效果[18-21]。

进一步分析丁香、罗汉果、山茱萸、五味子和黄连等药物对3种病原菌的MIC和MBC表明，山茱萸对3种病原菌的MIC和MBC值最低。山茱萸抑菌效果可能与其含有多种次生代谢物如马钱苷、单宁(鞣酸)等酚类物质以及酒石酸、苹果酸和没食子酸等有机酸有关[22]。有研究表明，酚类物质可通过破坏膜完整性和膜蛋白、影响DNA和RNA的合成、破坏线粒体功能等多种模式发挥抗菌活性[23,24]。鞣酸等有机酸可与细菌鞭毛、菌体表面酶类等结合，影响病菌的运动能力或使水解酶等失活，导致病原菌因细胞结构破坏和代谢停滞而死亡[25]。Payne等[26]发现单宁可通过抑制细菌葡萄糖基转移酶活性，从而抑制细菌生物膜的形成。虽然，本研究的结果表明12种中药提取物大部分都能抑制或杀灭供试菌株的生长，但同一菌株对不同的中药也表现出不同的敏感性。这可能与不同致病菌对不同中药所含有效抗菌成分的敏感度不同有关，因此在实际使用中应根据病原菌的种类选择合适的药物。

中药复方由多种药物组成，合理的单味药配伍组成复方可协同增效，抑菌效果比单味中药更佳[27]。同时，不同药物的配伍组方也有助于降低药物剂量的使用，降低毒性和细菌耐药性的出现[28,29]。多种中药配伍使用产生的协同效应可能与多种中药有效化学成分、多靶点、多途径协同抑菌有关[30]。Pei等[31]的研究指出丁香油酚/香芹酚的协同作用可能与香芹酚瓦解杆菌外膜，使丁香油酚更容易进入细胞质与蛋白质结合有关。Zhou等[32]的研究表明百里香酚可增强细胞膜的通透性，从而使肉桂醛更容易进入细胞。中药配伍产生拮抗减效可能与针对相关病原菌的有效成分在配伍组合中因相互结合、吸附等物理作用而降低有效成分的浓度，或者发生化学反应而失去原有的抗菌活性等因素有关。本研究中结果表明，不同中药联合使用对不同致病菌的抑制效果存在差异。其中，10种组合对嗜水气单胞菌的抑菌效果均表现为显著协同或协同作用，对溶藻弧菌的抑菌效果均表现为协同作用，对副溶血弧菌的抑菌效果则是无关甚至拮抗。这可能与副溶血弧菌对药物敏感性的机制与嗜水气单胞菌和溶藻弧菌存在显著差异相关。因此，本研究中12种中药及其组方对3种病原菌的有效抑菌成分以及抑菌机制还有待进一步研究。