鱼类Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因系统进化及其在有/无肌间骨代表鱼中的表达比较分析

廖 青 万世明 王旭东 高泽霞 ,

(1.华中农业大学水产学院, 农业农村部淡水生物繁育重点实验室/农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室, 武汉 430070;2.长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心, 武汉 430070; 3.湖北省名优鱼育种与健康养殖工程技术研究中心, 武汉 430070)

肌间骨(Intermuscular Bone, IB), 俗称肌间刺、鱼刺, 是由鱼类肌膈结缔组织连续同源骨化而来的膜骨[1], 根据自身直接或间接附着的位置可分为椎体小骨、髓弓小骨和脉弓小骨三种类型[2,3]。肌间骨仅存在于低等真骨鱼类中, 在系统演化过程中表现出数目由少到多, 由多到少再到无的特征[3—5]。鱼类肌间骨相关研究早在20世纪60年代便已开展[6],但多数研究集中在肌间骨发育及形态方面。近年来, 研究人员逐步开展了肌间骨发生发育分子调控机制方面的研究。Wan等[7]通过构建团头鲂肌间骨mRNA与miRNA组学数据库, 揭示了大量肌间骨发育的潜在调控基因[8,9]及其数目相关的SNP分子标记。陈宇龙等[10]发现tnmd基因对肌间骨的形成具有一定调控作用, Nie等[11]研究发现肌间骨的骨化类型为膜内骨化, Zhang等[12]发现骨形态发生蛋白(BMPs)家族基因对肌间骨的发育具有潜在调控作用。但总体来讲, 基因与肌间骨发生发育的关联性研究还非常缺乏。

胶原蛋白(Collagen)家族成员众多, 功能多样。其中, Ⅰ型胶原蛋白(Collagen type Ⅰ, COLⅠ)是骨细胞外基质的主要成分, 由col1a1和col1a2基因编码。Ⅱ型胶原多分布于骨骼和关节等组织, 由col2a1基因编码。哺乳动物中相关研究表明Ⅰ型和Ⅱ型胶原参与骨骼的矿化和生长过程[13—16]。在鱼类中, 胶原蛋白基因在骨骼发育中的表达调控作用也已被报道, 如col1a1在骨骼畸形的金头鲷(Sparus aurata)中表达下调[17],col10a1的表达在青鳉(Oryzias latipes)中标志着成骨细胞的早期阶段[18]等;Gistelinck等[19]以斑马鱼为模型研究了大量Ⅰ型胶原突变体的骨骼表型, 包括愈伤组织形成和肋骨弯曲等。但截至目前, 胶原蛋白在肌间骨发生发育过程中的表达调控作用还未知。

团头鲂(Megalobrama amblycephala)隶属于鲤形目(Cypriniformes), 鲤科(Cyprinidae), 鲌亚科(Culterinae), 鲂属(Megalobrama), 是我国特有的重要草食性经济鱼类之一[20]。团头鲂包含轴上肌中的髓弓小骨和尾部轴下肌中的脉弓小骨两种肌间骨, 其成年个体的肌间骨形态较为复杂。孵出后20d左右, 团头鲂幼鱼出现第一根肌间骨; 孵出后40d左右肌间骨基本完全出现; 之后随着鱼体的生长, 肌间骨的形态不断分化复杂[21]。尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)生长速度快, 肉质鲜美, 是世界上仅次于鲤的主要养殖鱼类, 也是我国主要养殖鱼类之一[22]。罗非鱼背部和尾部肌肉中均无肌间骨的存在[23], 即罗非鱼无髓弓小骨和脉弓小骨。因此, 这两种鱼类可作为探究鱼类肌间骨发生发育分子机制的比较模型。为探究胶原蛋白基因表达模式与鱼类肌间骨发育的相关性, 本研究以有肌间骨的团头鲂和无肌间骨的尼罗罗非鱼为研究对象, 探究有刺鱼和无刺鱼Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因的系统进化特征, 并进一步分析了Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因在个体不同发育阶段以及不同部位肌肉组织中的表达模式, 为发掘硬骨鱼类肌间骨形成的潜在分子调控提供了理论参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验所用团头鲂1龄样本和出膜幼苗均来自湖北百容良种有限公司; 尼罗罗非鱼1龄样本购自海南水产品市场, 出膜幼苗由广东海大集团友情提供。为测定Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白在不同组织中的转录水平, 随机抽取3尾1龄团头鲂[平均体重(143.23±53.77) g], 3尾1龄尼罗罗非鱼[平均体重(775.23±26.88) g], 用MS-222麻醉后解剖, 每个标本采集背上肌、尾上肌和尾下肌组织样品(包含肌间骨)。对于5—60 dph(Days post hatching, dph)的团头鲂和尼罗罗非鱼幼鱼, 使用MS-222麻醉后, 采集尾部肌肉,采样周期为5d。所有组织在采样后立即用液氮冷冻, 然后转入-80℃冰箱保存待用。

1.2 Total RNA提取及cDNA合成

用Trizol法(TaKaRa, 大连)从-80℃冻存的肌肉样品中提取Total RNA, 并用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测完整性。使用 NanoDrop ND-2000核酸蛋白仪(Thermo, 美国)测定RNA浓度及质量。参照HiScript Ⅱ Q Select RT SuperMix(Vazyme Biotech Co.,Ltd., Nanjing, China)试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA后, 于-80℃冻存备用。

1.3 Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因的克隆

Ensembl上下载斑马鱼col1a1a(ENSDART0000 0009393.6)、col1a1b(ENSDART00000015092.9)、col1a2(ENSDART00000042990.4)和col2a1b(ENSDART00000047844)的cDNA序列, 与课题组之前已获得的团头鲂尾部肌肉转录组序列[24]进行blast比对, 获得团头鲂col1a1a(MN580510)、col1a1b(MN 580511)和col1a2(MN580512)的完整CDS序列和col2a1b基因的部分CDS序列。利用Primer Premier 5.0软件进行引物设计, 送北京擎科生物科技有限公司武汉分公司合成(表1), 以转录的cDNA为模板进行PCR扩增。用1%琼脂糖检测产物质量后, 将条带单一的PCR产物送往武汉擎科生物技术有限公司测序。将测序获得的目的基因片段与已知片段比对拼接, 获得团头鲂col2a1b(MN580514)的完整CDS序列。尼罗罗非鱼col1a1(ENSONIT00000008 027.1)、col1a2(ENSONIT00000013579.1)和col2a1b(ENSONIT00000006473.1)的CDS序列直接从Ensembl数据库下载获得。

表1 团头鲂col2a1b基因克隆相关引物信息Tab.1 Primers used for col2a1b gene clone

1.4 Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因的同源性分析

使用NCBI ORF finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线预测基因开放阅读框, 使用ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)分析Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白的理化性质。用DNAMAN软件比较尼罗罗非鱼和团头鲂col1a1(a/b)、col1a2、col2a1b基因的相似度。使用NCBI BLAST查找并下载与目的基因同源性较高的序列, 使用MEGA7.0软件构建系统进化树。

1.5 Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因定量表达分析

参照已获得的Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白基因的序列信息, 以β-actin为内参基因, 设计定量引物(表2), 送武汉擎科生物技术有限公司合成。以团头鲂和尼罗罗非鱼不同发育时期样品和1龄鱼不同组织样品cDNA为模板, 参照试剂盒Hieff®qPCR SYBR®Green Master Mix (Low Rox Plus)(翊圣, 上海)说明进行qRT-PCR反应。采用2-ΔΔCt法进行转录本相对表达水平计算。使用SPSS软件及Duncan’s Multiple Range Test来比较基因在幼鱼不同发育时期及不同组织中的相对表达水平。

表2 基因qRT-PCR相关引物信息Tab.2 Primes used for qRT-PCR

2 结果

2.1 基因克隆及基因理化性质分析

基于序列同源性, 使用斑马鱼和草鱼基因序列克隆拼接了团头鲂Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白序列, 并在线验证开放阅读框的完整性。最终获得团头鲂Ⅰ型胶原蛋白col1a1a、col1a1b、col1a2及Ⅱ型胶原蛋白col2a1b的核心序列。其CDS序列长度依次为4347、4353、4059和3741 bp, 分别编码1448、1450、1352和1246个氨基酸。使用ProtParam 软件对基因进行理化性质分析(表3)。

2.2 基因同源性分析

使用DNAMAN对人(Homo sapiens)、鼠(Mus musculus)、鸡(Gallus gallus)、猪(Sus scrofa)、羊(Ovis aries)、团头鲂(M.amblycephala)及其他鱼类的Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白基因的氨基酸序列进行比较,并使用MEGA 7.0软件构建系统进化树。结果显示,团头鲂与斑马鱼4个基因的氨基酸相似度分别达到了94.23%(col1a1a)、90.46%(col1a1b)、93.32%(col1a2)和84.77%(col2a1b), 序列同源性较高(图1)。团头鲂和尼罗罗非鱼基因的氨基酸比对结果显示:团头鲂col1a1a、col1a1b和尼罗罗非鱼col1a1三个基因的氨基酸相似度为83.39%, 团头鲂col1a1a较尼罗罗非鱼col1a1的序列插入了157个氨基酸, 团头鲂col1a1b较尼罗罗非鱼col1a1的序列插入了159个氨基酸; 团头鲂与尼罗罗非鱼的col1a2的氨基酸序列相似度为67.38%, 团头鲂较尼罗罗非鱼的col1a2序列插入了272个氨基酸; 团头鲂与尼罗罗非鱼col2a1b的序列相似度为74.8%, 团头鲂较尼罗罗非鱼存在245个氨基酸的缺失(图1)。Ⅰ型和Ⅱ型胶原的系统进化树显示鱼类与哺乳类和家禽类的遗传距离比较远, 形成2个大分支。在鱼类大分支中, 针对有无髓弓小骨和脉弓小骨, 4个基因的系统进化分析都显示团头鲂、草鱼和斑马鱼等有刺鱼聚在一支, 而尼罗罗非鱼、半滑舌鳎和青鳉等无刺鱼聚在一支(图2)。

2.3 基因在不同组织的差异表达分析

以1龄团头鲂和1龄尼罗罗非鱼为材料, 采用qRT-PCR方法分析col1a1(a/b)、col1a2和col2a1b在躯体不同部位肌肉组织中的表达情况, 结果显示:Ⅰ型胶原蛋白(col1a1和col1a2)在团头鲂背部、尾部上方及尾部下方中的表达量依次下降, 在罗非鱼中则呈先上升后下降趋势(图3A和3B)。团头鲂col1a1a的表达水平显著高于col1a1b,col1a1a在团头鲂背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表达量依次显著降低(P＜0.01),col1a1b的表达则无显著性差异(P＞0.05)。罗非鱼col1a1在尾上侧肌肉中的表达量高于背侧肌肉中的表达量, 但二者无显著性差异(P＞0.05)。团头鲂与罗非鱼col1a2基因的表达模式与col1a1类似, 两种鱼类col1a2在背上肌肉与尾上侧肌肉中的表达量高低相反, 而在尾部上方与尾部下方肌肉中的表达量均显著性(P＜0.01)下降。此外, 表达分析结果表明col2a1b在团头鲂背部、尾部上方及尾部下方肌肉中的表达量依次降低, 在罗非鱼相应部位的表达量则依次升高(图3C)。团头鲂尾部上方与尾部下方肌肉中col2a1b的表达无显著差异(P＞0.05), 背部肌肉中的高表达量与尾部肌肉中的低表达量有极显著差异(P＜0.01); 而罗非鱼col2a1b在三个部位的肌肉中的表达依次显著升高(P＜0.05)。此外, 结果还表明Ⅰ型胶原蛋白基因在团头鲂(col1a1a和col1a1b)各部位肌肉组织中的表达量波动幅度都高于罗非鱼(col1a1, 图3A)。

2.4 胶原蛋白基因在不同发育阶段的表达分析

本研究采用qRT-PCR方法分析了目标基因在团头鲂和尼罗罗非鱼5—60 dph的表达变化。如图4所示, 团头鲂col1a1a从5—15 dph的表达呈上升趋势, 在20—40 dph表达量降至极低且无显著差异(P＞0.05), 而在50 dph左右表达量又出现极显著(P＜0.01)上升, 60 dph时表达量降低但仍在较高水平;col1a1b基因在各阶段的表达水平相对较低且较为稳定, 各阶段之间无显著差异(P＞0.05),col1a1b在15、50及60 dph的表达量显著低于col1a1a(P＜0.01)。尼罗罗非鱼col1a1的表达呈先上升后下降再回升的趋势, 从15 dph左右开始极显著(P＜0.01)上升, 在30 dph左右达到峰值, 40 dph左右表达量开始逐渐降低, 60 dph时表达水平又开始回升。在尼罗罗非鱼10—60 dph的发育过程中, 连续的每2个阶段间均有极显著差异(P＜0.01)。团头鲂col1a1a基因在15、50和60 dph的表达都比罗非鱼col1a1基因在对应时期的表达更为活跃。团头鲂的col1a1a在15、50及60 dph表达丰度极高, 表达量为相邻阶段的数十倍, 与其余各阶段均有极显著差异(P＜0.01);尼罗罗非鱼的col1a1在15和60 dph左右表达上升,变化幅度较小, 但与相邻阶段依然有极显著差异(P＜0.01)。

表3 团头鲂Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白基因的理化性质Tab.3 Physicochemical properties of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala

图1 团头鲂与尼罗罗非鱼Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因氨基酸序列比较Fig.1 Comparison of amino acids of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes in M.amblycephala and O.niloticus

图2 Ⅰ型和Ⅱ型胶原蛋白基因系统进化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of type Ⅰ and type Ⅱ collagen genes

团头鲂和尼罗罗非鱼不同生长阶段的col1a2在尾部肌肉中的表达模式非常相似, 整体呈先上升后下降, 再回升的趋势(图5)。团头鲂col1a2的表达在5—30 dph呈逐渐上升趋势, 到30 dph左右极显著(P＜0.01)上升到达峰值, 30—60 dph的表达为先下降后上升再下降的过程, 相邻阶段间的变化均有极显著(P＜0.01)差异。尼罗罗非鱼在5—30 dph呈上升趋势, 从15 dph开始极显著(P＜0.01)上升, 到25 dph左右表达水平达到最高, 25与30 dph的表达无显著差异(P＞0.05); 30—60 dph的表达为先下降后上升的过程, 相邻阶段间的变化均有极显著(P＜0.01)差异。此外,col1a2基因在团头鲂多个阶段的表达都比罗非鱼对应阶段更加活跃。

如图6所示, 团头鲂在尾部肌肉不同发育阶段的表达呈现了2次上升和下降的过程, 相邻两阶段间均有极显著差异(P＜0.01); 尼罗罗非鱼的表达仅呈现一次先上升后下降的过程, 在5—15 dph的表达无显著性差异(P＞0.05)。团头鲂col2a1b表达水平的2个峰值出现在15和50 dph左右, 尼罗罗非鱼col2a1b表达水平的峰值出现在30—40 dph左右,30与40 dph的表达水平无显著性差异(P＞0.05), 但与25和50 dph有极显著差异(P＜0.01)。

图3 col1a1(A)、col1a2(B)和col2a1b(C)在团头鲂和罗非鱼不同肌肉组织中的表达Fig.3 Expression of col1a1 (A), col1a2 (B) and col2a1b (C) in the different tissues of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

图4 col1a1在团头鲂和罗非鱼不同发育阶段中的表达Fig.4 Expression of col1a1 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

3 讨论

本研究对鱼类Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因表达模式与鱼类肌间骨发生发育的调控相关性进行了探究。在克隆获得团头鲂col1a1a、col1a1b、col1a和col2a1b基因CDS序列基础上, 比较分析了胶原蛋白基因在团头鲂与尼罗罗非鱼不同部位肌肉组织和不同发育时期(5—60 dph)尾部肌肉中的表达模式, 为探究Ⅰ、Ⅱ胶原蛋白基因在鱼类肌间骨发育过程中的潜在调控作用提供了一定的理论基础。本研究系统进化分析表明,col1a1、col1a2和col2a1在有刺鱼和无刺鱼都各自聚为一支, 提示这些基因与鱼类肌间骨表型形成潜在相关。研究还表明鱼类的col1a1b与col1a1a在进化树中明显分为2支, 鱼类的col1a1b与人、鼠和鸡等高级脊椎动物的col1a1更为靠近, 推测鱼类的col1a1在基因复制过程中发生了功能的分化[25], 鱼类col1a1b与高等脊椎动物同源性更高。

胶原蛋白能够引导钙盐沉积, 参与骨骼矿化[14],并通过其受体系统促进成骨细胞分化[15]。胶原蛋白基因在团头鲂和尼罗罗非鱼不同组织中的表达分析结果显示, Ⅰ型与Ⅱ型胶原蛋白基因在团头鲂背上肌肉中的表达量高于尾部, 而在罗非鱼中尾部肌肉的表达量高于背部。团头鲂Ⅰ型胶原蛋白从背部到尾部肌肉的表达呈逐步下降趋势, 而肌间骨的生长是从尾端向头端发育[21], 尾端肌间骨的成熟度较高, 团头鲂Ⅰ型胶原的表达与肌间骨的发育相吻合。与团头鲂相比, 罗非鱼没有髓弓小骨和脉弓小骨[23], Ⅰ型胶原蛋白在尾部上方肌肉中表达量最高, 可能是因为Ⅰ型胶原对肌肉质地的重要影响[26]。相较于尼罗罗非鱼,col2a1b在团头鲂背部肌肉组织中的表达量最高, 与团头鲂Ⅰ型胶原的表达模式相似, 推测Ⅱ型胶原与肌间骨的生长发育有一定的相关性[16]。不同生长阶段的表达图谱显示, 在团头鲂中,col1a1a和col2a1b基因在15和50 dph分别达到高峰, 且以col1a1a的表达变化最为显著; 在尼罗罗非鱼中,col1a1的表达量在30和60 dph分别达到峰值,col2a1b的表达在30 dph达到最高峰。据万世明等[21]的观察, 团头鲂的肌间骨在20 dph左右开始萌发, 至40 dph左右基本全部出现。在本研究中团头鲂Ⅰ型胶原蛋白在15 dph(肌间骨出现前)出现第1次表达峰值, 可能是因为骨骼矿化需要大量的胶原补充[13,14];第2次表达峰值(50 dph)出现在肌间骨完全出现后的快速生长期, 这可能是因为Ⅰ型胶原能增强成骨细胞的成骨能力, 并在一定程度上决定骨的韧性和质量[13—15], 所以其表达在肌间骨的成熟和固化过程中再次上调。在本研究中, 团头鲂的col1a1a在不同发育时期的表达量差异巨大, 峰值极高, 与col1a1b的表达水平有明显差异, 与进化树分析结果相吻合, 提示col1a1在进化过程中发生了功能的分化[25];col1a1a在15和50 dph表达丰度极高, 提示col1a1与鱼类肌间骨发育存在潜在关联。

图5 col1a2在团头鲂和罗非鱼不同发育阶段中的表达Fig.5 Expression of col1a2 at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

图6 col2a1b在团头鲂和罗非鱼不同发育阶段中的表达Fig.6 Expression of col2a1b at different developmental stages of M.amblycephala (M.a) and O.niloticus (O.n)

本研究通过肌腱和骨发育相关的Ⅰ、Ⅱ型胶原蛋白基因的CDS区克隆和同源性分析, 推测鱼类Ⅰ型和Ⅱ型胶原与鱼类肌间骨的表型相关。结合尼罗罗非鱼和团头鲂不同组织和不同发育时期的基因表达分析, 明确col1a1基因的表达与鱼类肌间骨发育有一定的关系, 为肌腱发育形成肌间骨提供了一定的理论支持。