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本文转载自《农业生技产业季刊》2009年NO.20（有删改），作者洪健睿、吴鸿程。在水产养殖蓬勃发展的同时，病害也在困扰着养殖户们，水产先声精选此文，结合网络资料，整理成文，供广大水产养殖的朋友学习与思考。知识，永远也不会过时；学习，永远都不晚。

前言

水产养殖业者欲侦测种鱼、鱼卵、稚鱼、成鱼、饲料及培育环境是否潜含病毒，政府相关单位监测养殖场病毒危害情况时，皆需要有可信的检测方法，目前实验技术日新月异，新颖快速的方法不断进化，检测诊断之准确性也大幅度提升。以下整理与摘要说明检测鱼类病毒的方法原理及目前研发的实况。

鱼类重要病毒的分子检测技术

对未知病源体的首次鉴定，通常要依柯霍法测(Koch'spostulates)，培养及纯化病源体，若依此法则历程，所需时间太长，难用于疫情的监控。当疾病病源体确定后，后续的诊断方法已经由科技方法创新，大幅度缩短操作分析时间。在众多的诊断方法中，病毒引发鱼类疫病之诊断鉴定，主要是鉴别病毒的蛋白质或是遗传物质（DNA或RNA），检测技术可分为：血清学检测技术及分子生物学检测技术两类。

一、血清学检测技术

主要是以病毒的蛋白质为抗原，以免疫学的原理，产生可判识病毒蛋白质的抗体，此类技术亦称为免疫检测技术。通常以病毒的结构性蛋白质为抗原，可测定检体中是否有病毒存在。若要检测病毒在检体中是否处于活跃的复制期，常以非结构性蛋白质为抗原。如，神经坏死症病毒的B2蛋白质（Su,2009；图一所示）。血清学检测技术的关键性条件，是生产具有特异性抗体，尤其是单株抗体，可增强检测技术的敏感性及准确性，目前在NNV已有丰硕的研究成果(Shieh,2005)。

当抗体和抗原结合后，为了放大结合讯号利于判读，其标示的方法，常用的方法为胶金标志法(colloidalgold-labeled)、酵素连结免疫吸附法(enzyme-linkimmunosorbentassay,ELISA)等两大类及较新颖的免疫磁减量检测系统。相关说明如下：

1.快速检测试剂套组(one-stepdiagnosiskit)

此试剂主要是根据胶金标志，同时配合免疫层析法，所研发出来的快速诊断法，目前市售的验孕棒均以此技术制作而成。胶金标志的原理係利用氯金酸(HAuCl4)在还原剂作用下，可聚合成一定大小的金颗粒，形成带负电的疏水胶溶液，在静电作用下形成稳定的胶体状态，故称为胶金。由于胶金颗粒表面所携带负电荷对于蛋白质表面所带之正电荷具有相当强之吸附能力，可形成非共价结合。当胶金标记物与相对应的蛋白质在结合处大量聚集时，肉眼即可见红褐色或紫色斑点，因而可用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。免疫层析法是先将抗体固定在硝化纤维膜上（或是其他材质），使其无法移动而成为固定相，测试时将硝化纤维膜一端浸入液态待测样品内，以毛细作用力，将液体吸往固定的抗体区，配合胶金标志的呈色机制，当有抗体和抗原大量结合时，可在标示区显示颜色，达成快速检测诊断之目的。此试剂具有简单、快速、专一又便宜的优点，适合专业及非专业人士操作，且方便于养殖现场使用（齐，2006）。

2.酵素键结免疫吸附法(ELISA)

此测定方法是将酵素以化学键结方式标记于抗体或抗原上，当相对应之抗体或抗原结合后，形成有酵素标记之免疫复合物，一旦免疫复合物上之酵素遇到相对应之酵素基质，则可将无色之酵素基质催化成有色之产物，放大免疫复合物的讯息，再依据颜色深浅或有无，进行定量或定性分析。分析时，使用已经固定在96孔盘上的抗体或抗原，形成固定项，加入待测样品，经结合形成免疫复合物，用水冲洗未能结合的物质，再加入相对的酵素标记抗体或抗原，水洗后加入酵素基质呈色。市售之ELISA试剂套组通常会具备三种基本试剂材料，包括固相的抗原或抗体、酵素标记之抗原或抗体、酵素基质。依据应用性、样本之性状及检测所需具备之条件，目前设计出各种不同之检测方法，包括双抗体三明治法、间接免疫吸附法、竞争法、阻断法或捕获法等。ELISA因一次可进行多样本的分析，适合定量分析，由于实验结果需要特殊判读机，常用于实验室内，不适于养殖现场使用。

3.MagQu的免疫磁减量检测系统

此系统是将抗体以共价键方式结合在MagQu磁量生技公司出品的磁珠上，当磁珠上抗体与病毒结合后，造成个别磁珠聚集，减少磁珠在磁场的旋转量，称为免疫磁减量(简称IMR)，IMR测定仪中可将微弱的磁讯号转变为可量测的电压讯息，具相当高的灵敏度。中研院吴金洌特聘研究员与海洋大学吕明伟助理教授，以鱼类的神经坏死症病毒(NNV)，透过磁珠转动速度来侦测NNV病毒量，可以侦测102TCID50/ml以下的病毒量，显示此技术具有高度检测敏感性。此外，进行专一性试验，此平台进行胰脏坏死症病毒及虹彩病毒等两种病毒检测，所得之检测值皆低于背景值，显示本技术平台具有可信赖的检测专一性。

二、分子生物学检测技术

在鱼体初期感染或是健康带源鱼体内，病毒之遗传物质DNA或RNA的含量不多，不易检测。1983年KaryB.Mullis博士发明了聚合酶链反应(PCR)技术，开启了分子生物学的新领域。PCR技术之必备要件包括核酸模版、引子、耐高温之DNA聚合酶、四种合成硷基之去氧核糖核苷三磷酸，在可设定温度循环参数之反应仪中，透过高温将双股DNA变性成单股，而后降温让人工合成之引子得以与模版单股DNA上可配对之硷基结合，而后再提升至适合DNA聚合酶催化之温度，催化依模版DNA序列合成互补性DNA。若病毒之遗传物质为RNA，必须先经过反转录(reversetranscription,RT)使RNA变成cDNA(complementDNA)，才进行PCR反应。由于聚合酶链反应技术操作简便、敏感度很高，PCR仪器便迅速普及于一般实验室，是目前最常用于诊断动物疾病的技术。若要定量病源体含量，通常会配合胶体电泳分析，但合适的PCR循环次数却不易决定。近期以PCR技术为基础，已发展出快速精准的即时定量PCR(Real-timePCR)及恒温圈环形核酸增幅法(LAMP)等。

1.即时定量PCR

即时定量PCR是利用与DNA结合的特殊萤光染料，当PCR扩增DNA时，DNA会与萤光染料结合，增强萤光强度。经由测定萤光强度，可即时判定DNA含量，整个PCR反应过程中，可完整记录DNA含量的变化，有别于传统PCR将DNA增幅放大后，将DNA标定萤光物质，再进行电泳分析并侦测萤光值，进而定量。以即时定量PCR测定石斑鱼神经坏死病毒，其侦测灵敏度高于传统PCR十倍以上（庄，2004）。即时定量PCR的灵敏度高，只要设计专一性核酸引子，在定量方面，其准确性及时效性有很好的表现，但需要特殊仪器且较难携带，常用于一般实验室，不适合野外、鱼场使用。

2.微流体即时定量PCR

PCR仪器，主要是提供可调式的温度控制。若要改善即时定量PCR仪器之可携带性，首要条件就是缩小仪器。台湾电子资讯产业在全球能独据鳌头，所依据的就是发达的微机电系统。微机电系统技术是一种包括光、机、电、材料、控制、化学、生医等多重科技整合的技术，利用此制造技术可使产品因微小化而提高其性能、品质、可靠度及附加价值，同时可降低制造成本。成功大学陈宗岳副教授及李国宾特聘教授共同合作，以微机电制程技术，开发出微型微流体检测晶片技术，该项技术并已经技转承虹科技公司。此系统包含微型温控模组与微流体输送模组。前者由于感测器及加热器都整合在PCR晶片的内部，晶片得以快速且准确执行温度的循环控制，后者整合蠕动式微型气动帮浦与微管道，提供了生物相容性高及可抛弃性。以微流体晶片系统对神经坏死病毒之RNA片段进行侦测，侦测极限最低浓度可达到每微升10个病毒RNA，若增加萤光侦测模组之侦测极限，2009年的研究雏型仪器最低浓度可达到每微升为1,000个病毒RNA，此项技术，除可将仪器微型化，亦增加系统携带性（李，2008）。

3.恒温圈环形核酸增幅法(LAMP)

Notomi在2000年研发出只需一个反应温度之核酸扩增技术LAMP，并取得该项技术的专利。LAMP具有快速、高专一性及高敏感度之特点，仅需于60-65°C恒温下反应35分钟至1小时即可侦测病毒，操作简单且不需昂贵的设备，适合应用于养殖现场。LAMP所用之DNA聚合酶为具核酸股置换活性的BstDNA聚合酶，在标的DNA片段选取6个区域，设计成2对专一性的内引子及外引子，藉由聚合酶作用，扩增标的DNA片段，可专一性的侦测特定病毒。因内引子之特殊设计，扩增产物会由许多茎-环结构的DNA连结，在LAMP反应中，三磷酸去氧核苷酸(dNTP)在进行DNA的合成时，会释放出磷酸根离子和反应缓冲液内镁离子，形成白色焦磷酸镁沉淀，可经由副产物焦磷酸镁所形成之白色沉淀物或将DNA产物以萤光剂染色，快速以肉眼观察结果。在RNA病毒方面，需配合可在高温反应的反转录酶(AMVRTase)。LAMP检测技术，不同于PCR，只需一种操作温度，不需要有升温及降温的动作，因此反应时程也比传统PCR快，方便养殖现场应用，因此可及早侦测水产生物是否感染病毒，避免引入带病毒之鱼种，并可在养殖期间做好监控措施，减少病毒爆发及疫情扩散。但LAMP引子设计复杂且限制多，是急需突破之瓶颈。目前已应用于许多水产生物，包括石斑鱼神经坏死症病毒检测(Xu,2009)。

鱼类病毒的分子检测技术研发方向

鱼类病毒的分子检测技术，主要是利用酵素免疫、化学呈色发光及分子生物学。而检测试剂需要下列的要求：(1)准确性：精准及特异性的检测出标的物质；(2)敏感性：能在标的物质非常稀少情况验出；(3)稳定性：检验试剂在长时间存放不易变质；(4)简易性：仪器简便，易于携带；(5)经济性：价格便宜，养殖业者能负担，便于大量筛选样本。目前的检测试剂仍无法完全符合上述条件，但若能针对某些使用者的需求加以研发，仍大有可为。针对使用对象的需求，可将检测试剂研发分为二个方向：

一、养殖现场使用之简易型

养殖环境的检测是防疫的第一线，最好是有生产履历性的全面检测，也是最需要快速检验的关键地方。但养殖现场中没有研究设备，所以检测试剂之使用要简单、快速、便宜、不需要专业检验人员，可随时随地检测，试剂保存容易者为佳。渔业的检测通常需要在现场检测或者立即得到检测结果，现场使用常以快速检测试剂套组为主，而快速检验试剂套组主要利用免疫技术结合胶金标志，目视即可判断结果，然而检体通常并非纯物质，所含的夹杂物质易造成非特异性结合之伪反应，使准确性下降，最好能使用单株抗体以提高专一性，所以研发的重点包括如何生产便宜的单株抗体。免疫磁减量检测系统，不需用水洗为其特色，若测定仪体积能小型化，则更方便于养殖现场使用。LAMP技术虽然只需要单一温度设备，亦能应用于养殖现场，但是DNA聚合酶的稳定性、多对引子对的设计及萤光染料的价格等，仍有需要改进的空间，目前仍在先导期实验中。微流体即时定量PCR，以微流体晶片结合萤光侦测模组，将即时定量PCR仪器缩小为可携带型，增加其便利性。由于微流体即时定量PCR与LAMP的检测标的物皆为DNA或RNA，因此须开发简易且效果佳的纯化套组以搭配使用。

二、实验室使用

政府、学校、民间研发单位，有专精的检验人员及设备，除了可用上述养殖现场使用之简易型检验试剂外，ELISA及即时定量PCR，因有仪器辅助，故其可检测之种类相当多，且可用于标的物定量，扩大其使用范围及精确性。由于遗传工程、基因重组及单源抗体等技术的不断研究与发展，使得研发期程大幅缩短，实验室使用产品推陈出新更为迅速。

鱼类病毒的分子检测技术研发方向

由于石斑鱼在鱼苗养殖阶段，常遭受神经坏死病毒为害，而在成鱼则面临虹彩病毒感染之威胁。朝亚太种苗中心发展，应建立生产优质无病毒鱼苗技术，除了在饲育管理外，开发饲料添加物，将促进生长或用来治疗及控制疾病的产品添加入饲料，提升鱼抵抗疾病的能力；在环境管理面，则彻底执行养殖场的卫生管理，例如养殖场环境、孵化池和水源消毒等，可以避免病源侵入养殖场的机会（周，2008）。除此之外病毒检测亦是重要一环，兹将病毒检测技术应用性分列如下：

1.筛选无病毒种鱼

以PCR进行病毒检测，去除带原之种鱼，这是生产优质无病毒鱼苗的第一步，源头无法控管，将无法带动无病毒鱼苗。

2.筛出病毒带原鱼

台湾养殖的石斑鱼普遍有NNV带原的现象，带原现象不只存在于发过病的残活鱼，也存在看似健康的鱼体内。持续性感染鱼可以释放具感染性的NNV至饲养环境中，会造成NNV在环境中的散佈。当鱼筛出为病毒带原鱼者，应将残活鱼销毁，以防疫情扩大。

3.饲育及环境管理之病毒监控

无病毒饲料及环境的维持是养殖上的一大重点，亦是开发现场使用病毒检测套组的主要使用对象，因为养殖业者需要进行长期且多项目之监控。

4.疫病的快速鉴定

当疫病大流行时，病源体鉴定的准确性及时效性相当重要，有效的鱼病检测系统能快速决定药物治疗策略，或将无法治疗的病体销毁，避免疫情扩大。

5.检疫制度的建立

由疫区运送往非疫区的种苗必须严格要求提出检疫证明，藉以防止种苗运送所造成之传播。检疫证明须由政府可信任之检验单位提出。

6.生产履历的建立

纪录种鱼、稚鱼、成鱼等各阶段之完整生产过程及病毒监控结果，除了可作为优质无病毒鱼苗的证明外，更可提供消费者最安全的水产品。

鱼类病毒的分子检测技术研发方向

水产养殖业要立足台湾，放眼世界。在WTO前提下，经济已呈现全球化，台湾水产养殖应由劳力密集及高度依赖水及土地资源的传统养殖，进化到以资讯、知识、技术密集的种苗产业。以种苗为另一个出发点，建立“优质”水产品的形象，以确保台湾与国际上其他国家水产品之产品区隔，迅速发展成为亚太种苗中心。政府依此目标，建立相关政策，由产官学共同参与、推动及落实。在疾病防治方面，由上游学术机构合力研究病因、病源检测鉴定方法，再技转民间生产。配合民间推广单位，如：水产种苗协会，推进科技及产业结合，辅导产业养殖环境改善，办理鱼苗品质认证制度，提升整体产品竞争力。鱼苗生产业者，可利用快筛试剂进行鱼苗健康之自我监控，建立生产履历；政府卫生试验单位，则执行水产动物疾病监测工作，长期监测养殖场病毒危害情况，了解养殖鱼病毒的感染实况。由上而下整合研究科技，由内而外保证鱼苗优质、无病毒，如此水产养殖产业将能永续发展。