草鱼细菌性败血症致病菌的分离和鉴定研究报告

发表时间:2022/2/24 21:20:52  来源:腾氏水产  浏览次数:15925  
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摘要


2018~2021年,从辽宁省沈阳市辽中区水产养殖区患细菌性败血症(bacterial septicemia)的草鱼(Ctenopharyngodon idella)体内,共分离获得64个菌株。


经鉴定其中有54个菌株属于嗜水气单胞菌(Aaeromonas hydrophila)。采用注射感染的方式,分别检测了A.hydrophila的54个分离菌株对健康草鱼的致病力。试验结果证明,分离菌株对健康草鱼均具有一定的致病力。但是,不同分离菌株对健康草鱼的致病力大小存在明显差异。


对于养殖草鱼(Ctenopharyngodon idella)的细菌性败血症(bacterial septicemia),抗生素类“国标渔药”的治疗效果越来越差[1,2]。在我国不同的水产养殖区均属于能引起严重经济损失的鱼类病害。为了研制免疫防控这种疾病的“自家疫苗”[3],我们于2018~2021年的养殖期内,从患病草鱼体内分离、收集到了一些致病菌株,完成了分离菌株的种属鉴定与致病力研究。现将结果报告如下。


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01材料与方法


1.1致病菌的分离


2018年6至2021年6月,在位于辽宁省沈阳市辽中区的多个水产养殖场,从患细菌性败血症的草鱼的肝、脾和肾脏中,用BHIA(Diffco)培养基分离致病菌株,将分离接种后的培养皿置于25℃恒温培养箱中培养48 h,取单个菌落进行纯分离后,取分离纯化后的致病菌菌株,接种在试管内斜面培养基上。备作鉴定其种属的分离菌株。


1.2分离致病菌株的种属鉴定


将从患病草鱼体内分离获得的64个分离菌株,送到华中农业大学水产学院徐镇教授的实验室,采用检测分离菌株生理生化特性并结合16S rRNA基因分子鉴定的方法[4,5],对分离菌株完成了所属种属的鉴定。


1.3 嗜水气单胞菌活菌液的制备


对于鉴定为嗜水气单胞菌(Aaeromonas hydrophila)的54个分离菌株,接种在BHIA培养基中,置于25℃恒温培养箱中培养48 h后,用灭菌生理盐水洗下菌苔,并且以离心法集菌。再以灭菌生理盐水将菌液浓度调节为106cfu/mL,置于4℃冰箱中保存,作为接种健康草鱼的A.hydrophila活菌液,冷藏备用。


1.4供试鱼与分离菌株的毒力测定


将每尾鱼体重为25.0~30.0g、外观无伤的草鱼鱼种,在每个盛有1.0M3去氯自来水的圆形玻璃钢水族箱中,放养30尾供试草鱼。按照供试鱼总体重,每天投喂1.5%的人工配合饲料,连续饲养7d后,检查供试草鱼体表有无受伤,活动是否正常。将身体无伤、游动正常的草鱼留下作为供试草鱼。在试验期间,水族箱中水体的温度保持在22~25℃之间。


将上述浓度为106cfu/mL的A.hydrophila活菌液,对每尾供试草鱼的胸鳍基部注射0.25mL,作为活菌攻毒的试验组。每个分离菌株的活菌液注射10尾供试草鱼,以剪去供试草鱼少量左、右胸鳍鳍条,作为注射不同分离菌株的标识后,每个水族箱共放养30尾供试草鱼。以注射相同剂量灭菌生理盐水的草鱼,作为未注射分离菌株菌液的对照组。


将注射接种A.hydrophila活菌液后的供试草鱼,放回水族箱继续充气饲养观察14d,记录供试草鱼出现病症与死亡发生的时间,对死亡鱼体进行致病菌再分离和解剖检查,判定是否死于人工接种致病菌的感染。根据供试草鱼的死亡数量,评价分离A.hydrophila菌株对健康草鱼的致病力。


02结果


利用从2018~2021年间,由辽宁省沈阳市辽中区水产养殖场出现的患病草鱼体内,分离获得的A.hydrophila共54个菌株,对供试健康草鱼注射0.25mL菌液浓度为106cfu/mL的A.hydrophila活菌液后,观察到供试草鱼在14d内的死亡情况见表1所示。由表1所示数据。


表1供试草鱼在注射嗜水气单胞菌(A.hydrophila)

活菌液后的死亡时间与数量

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可以看出所有A.hydrophila活菌液,均对健康草鱼具有不同程度的致病力。但是,不同的分离菌株毒力强弱存在显著差别。有部分分离菌株在接种健康草鱼后的7d内,均可导致全部供试草鱼死亡。经过对死亡鱼体再分离致病菌时,也证明是由于人工注射A.hydrophila活菌液致病死亡。


03讨论


2018年6月至2021年7月,从辽宁省沈阳市辽中区水产养殖区患细菌性败血症的草鱼肝、脾和肾脏中,共分离到64个分离菌株。经生物化学特性和分子生物学方法鉴定其致病病原主要为气单胞菌的一些种类,其中有54个菌株被鉴定为A.hydrophila。


根据过去已有的研究结果,不同菌株的A.hydrophila体内存在毒力因子的状况是有差异的。在本研究中采用的注射活菌液的感染的方式,获得了与前人相似的研究结果,即对健康草鱼注射接种相同剂量的A.hydrophila活菌液后,供试健康草鱼的死亡率为30.0%至100.0%之间。


为了研制用于预防辽宁省沈阳市辽中水产养殖区养殖草鱼细菌性败血症的“自家疫苗”,我们还将对这些具有较强毒力A.hydrophila菌株的血清型状况,做进一步的研究。


参考文献

[1]陈昌福,冯东岳,陈辉,张朝晖,方苹. 对减少渔药用量行之有效的几条措施[J]. 当代水产,2017,12,78~79.

[2] 陈昌福. 试谈水产养殖动植物病害防控中的问题与对策[J]. 中国水产,2014(3):71~73.

[3]陈昌福,李清,陈辉. 试谈研制水生动物用“自家疫苗”的必要性与管理规范. 当代水产,2018,5,76~78.

[4]布坎南.伯杰.细菌鉴定手册[M].第8版,北京:科学出版社,1984,482~485.

[5] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001,162~171.

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