虹鳟卵孵化中水霉病的防控

       张元

    （山西省水产育种养殖科学实验中心，山西 太原 030002）

在水温9～11℃下，研究不同浓度过氧化氢、甲醛、聚维酮碘和中草药（五倍子、麻黄等）浸提液对虹鳟受精卵发眼率、孵化率和畸形率的影响。结果表明：聚维酮碘不适合用于虹鳟受精卵水霉病的防治，其他三种消毒剂的最佳药浴浓度分别为过氧化氢1 000mg/L、甲醛1 500 mg/L、中草药浸液50mL（仅限于本试验配方），发眼率可分别提高到发眼率可分别提高到（96.54±1.16）%、（97.76±2.36）%、（94.26±3.58）%，孵化率可分别提高到（97.99±0.13）%、（98.24±1.09）%、（98.10±1.09）%。将这三种消素剂两两交替使用后，发现过氧化氢和中草药的防治效果不低于甲醛，为今后研发防治水霉菌的无公害新型药物提供基础性数据。同时，建议在孵化中建立一套科学、严格、有效的防疫体系，既可大大减少消毒剂的使用量，又可真正达到安全、高效、价廉。

虹鳟受精卵；发眼率；孵化率；畸形率；防控水霉病

虹鳟Oncorhynchus mykiss原产于北美洲的太平洋沿岸，目前成为世界上养殖分布最广的鱼类之一[1]。虹鳟肉质肥厚细嫩、味鲜美、无腥、营养价值高，在淡水和海水中均能养殖，适宜于高度集约化养殖。我国的虹鳟人工繁殖、养殖技术日趋成熟，现已在我国大部分地区进行养殖，尤以黄河流域及其以北地区最盛[2,3]。

然而，虹鳟受精卵孵化温度较低、孵化时间较长，极易感染水霉Saprolegnia，严重影响成活率和养殖效益。水霉菌对寄主没有严格的选择性，可以感染草鱼Grass carp、虹鳟、黑鱼Ophicephalus argus等诸多水产养殖动物的各个生长阶段，使卵、苗种或成体患染水霉病（又称肤霉病或白毛病），具有极大的危害性[4-6]。孔雀石绿曾是预防、治疗水霉病的有效药物，但由于其“高毒性、高残留、高致癌”，2002年被农业部列入《食品动物禁用的兽药及其它化合物清单》[7,8]。目前生产中常用的替代药物，如氯化钠、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、二氧化氯、聚维酮碘、臭氧、中草药等，低剂量使用时，往往难以彻底抑制水霉菌生长，而某些药物高剂量使用又会造成畸形苗或潜在药残危害。本研究采用试验生态学方法研究不同浓度过氧化氢、甲醛、聚维酮碘和中草药浸提液对虹鳟受精卵发眼率、孵化率和畸形率的影响，旨在摸索一套高效、安全、价廉的虹鳟受精卵水霉病防治体系，以提高孵化效率。

1 材料与方法

1.1 材料

本试验在山西省水产育种养殖科学实验中心朔州虹鳟鱼实验场进行。通过人工催产、授精方式获得虹鳟受精卵。平行组与各实验组均取受精卵约1万粒，平均卵径为（5.22±0.64）mm，置于10L的桶式孵化器中孵化。试验过程中，水体的溶解氧平均值为（6.89±0.43）mg/L（使用JENCO 9010M测定），pH为（7.82±0.01）（使用HANNAHI 8424测定）。

过氧化氢溶液（分析纯30%，哈尔滨新春化工有限公司）、甲醛溶液（浓度37%，南京化学试剂股份有限公司）、聚维酮碘（山西益鑫泰生物科技有限公司）、中草药（五倍子、麻黄、土槿皮、旱烟草杆、大蒜素等）。中草药粉碎后取15g，于4℃下浸泡6h以上，用100mL蒸馏水煮沸后再文火煎煮40min，重复煮3次后合并煮液，加热浓缩至150mL备用，使用时再用蒸馏水稀释10倍即得到中草药浸提液。

1.2 方法

首先筛选消毒剂种类和使用剂量。每天上午8:00～9:00药浴40min，药浴水温在9～11℃之间。各消毒剂设1个空白对照和5个浓度梯度，每个梯度设 3个平行。过氧化氢溶液：0mg/L、500mg/L、800mg/L、1000mg/L、1200mg/L；甲醛溶液：0mg/L、500mg/L、1000mg/L、1500mg/L、2000mg/L；聚维酮碘溶液：0mg/L、50mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L；中草药浸提液：0mL、20mL、50mL、80mL、100mL。

当受精后累积温度达到100℃时检测受精率[1]。待发眼后停止消毒，挑出死卵。采用重量法统计发眼率和孵化率，直接计数畸形率。

然后，根据上述试验结果设计消毒剂两两交替使用试验，前期使用的消毒剂标为A，后期使用消毒剂的标为B。A使用5d、7d、10d三个梯度，之后至发眼前使用B（表1）。

1.3 数据处理

使用SPSS 21.0统计分析软件处理数据，根据以下公式计算各百分比：

表1 消毒剂搭配方案与使用时长Tab.1 Collocation scheme and usage period of various disinfectants in the experiments

2 结果与分析

2.1 各消毒剂对受精卵的影响

由表2可知，各剂量过氧化氢、甲醛和中草药组受精卵的发眼率均极显著高于空白对照组（P＜0.01）；聚维酮碘中仅有50mg/L组的发眼率显著高于空白对照组（P＜0.05），100 mg/L试验组极显著高于空白对照组（P＜0.01）；除聚维酮碘150mg/L、200mg/L试验组外，其他各试验组的孵化率与空白对照组的差异均不显著（P＞0.05）；过氧化氢、甲醛和中草药组的畸形率与空白对照组间无显著性差异（P＞0.05），聚维酮碘50mg/L以上剂量试验组的畸形率均极显著高于空白对照组（P＜0.01）。

2.2 不同消毒剂组合对虹鳟受精卵的影响

由表2可知：各药浴浓度聚维酮碘受精卵的发眼率均极显著低于其他三种消毒剂（P＜0.01），但畸形率均极显著或显著高于空白对照组和其他三种消毒剂（P＜0.01或P＜0.05）。对这三种消毒剂分别与发眼率、孵化率和畸形率之间的双变量双侧T检验结果表明：不同药浴剂量与发眼率之间存在着极显著相关性，而与孵化率、畸形率之间不存在显著相关性。因此，后续试验中所使用的消毒剂种类和剂量分别为：过氧化氢溶液1 000mg/L、甲醛溶液1 500 mg/L、中草药浸液50mL；在不同消毒剂组合试验中仅对发眼率进行统计。

表2 各消毒剂对虹鳟受精卵的影响Tab.2 Influence of the disinfectants on fertilized eggs of rainbow trout

由表3可知：虹鳟受精卵经六组不同消毒剂组合处理后，使用5d消毒剂A情况下，6组的发眼率之间无显著性差异（P＞0.05）；使用7d消毒剂A情况下，第三组（甲醛+过氧化氢）的发眼率极显著高于第五组（中草药+过氧化氢）和第六组（中草药+甲醛）（P＜0.01），显著高于第二组（过氧化氢+中草药）（P＜0.05）；使用10d消毒剂A情况下，第三组（甲醛+过氧化氢）和第四组（甲醛+中草药）的发眼率极显著或显著高于第五组（中草药+过氧化氢）和第六组（中草药+甲醛）（P＜0.01或P＜0.05）；5d和10d的发眼率之间无显著性差异（P＞0.05）。再对A使用时长与各组间进行双变量双侧T检验，结果显示：7d、10d情况下，两者间具有显著的相关性（P＜0.05）。

表3 不同组合消毒剂对虹鳟受精卵发眼率的影响Tab.3 Influences of different disinfectants combination on eyed embryo rate of fertilized eggs in rainbow trout

3 讨论

3.1 四种消毒剂对虹鳟受精卵水霉的抑制作用

从受精卵至鱼苗孵出，常以受精卵的发眼率、孵化率和畸形率来综合评价虹鳟的孵化效果。水霉菌为孵化期间常感染的病菌，显著影响虹鳟受精卵孵化的成活率。因此，常用控制受精卵水霉菌的效果来评估消毒剂的抑菌效果。

水霉为具有一定真菌特征而非真菌的类真菌生物[9-12]，防治难度很大。本试验选择目前生产者最常用的四种消毒剂处理受精卵。结果表明，过氧化氢、甲醛和中草药三种消毒剂在各药浴浓度下，受精卵的发眼率均极显著或显著高于对照组，说明这三种消毒剂对水霉均具有抑制效果用。然而所有浓度下的孵化率之间无显著差异，这与国外众多学者的研究结果相近[13-15]。而各研究结果的最佳药浴浓度略不相同。本研究表明：各药物的最佳药浴浓度分别为：过氧化氢溶液1000mg/L、甲醛溶液1 500 mg/L、中草药浸液50mL。其主要原因是：各试验的药浴水温不同，水霉的滋生情况即不同；样本数量也有所差异；亲本健康程度亦影响受精卵的质量、受精率和抗病力等。

本试验发现，用聚维酮碘时，发眼率极显著低于其他三种消毒剂，畸形率极显著高于对照组。因此认为，聚维酮碘不适于防治虹鳟受精卵的水霉菌病。

3.2 四种消毒剂对虹鳟受精卵的毒性

试验或生产中常以孵化率和畸形率作为衡量所使用药物对受精卵毒性的标准。本试验表明：过氧化氢、甲醛和中草药组的畸形率与对照组无显著性差异；150～200mg/L的聚维酮碘下孵化率显著低于对照组和其他试验组，而畸形率极显著高于对照组，说明高浓度聚维酮碘对虹鳟受精卵具有明显致畸影响，过氧化氢和中草药无毒副作用，这与一些研究结果相似[16,17]。甲醛预防虹鳟受精卵水霉菌的效果毋庸置疑，但存在对作业人员健康有害、易在鱼体内残留、影响水域环境等危害，在日本等国家已限制使用[18]。因此，筛选有效防治水霉菌的消毒剂，建立水霉菌防疫体系是目前研究的重点。

本试验确定的过氧化氢、甲醛和本中草药联合使用方法，可避免盲目加大消毒剂用量而导致的畸形率增高。正确使用这些方法，不仅能提高虹鳟受精卵的发眼率和成活率，降低畸形率，且后期仔鱼能安全、健康和快速生长。

3.3 不同组合消毒剂对虹鳟发眼率的影响

孵化期间，死卵极易滋生水霉。在水温10℃下，一般4d后就开始着生水霉，伸出银白色菌丝将邻近健康卵包围起来，使其窒息死亡。本试验中，前期使用A消毒剂的时间超过4d，最低梯度定为5d。而一般测定受精率的时间为积温达到100℃时，当温度为10℃时，即10d，因此最高梯度定为10d。本试验首次突破虹鳟卵从授精到发眼过程中使用单一药物的消毒杀菌的习惯，将不同消毒剂组合起来使用，且设定了不同使用时长梯度。

受精卵经六组不同组合处理后，前期使用5d消毒剂A梯度下，六组的发眼率之间无显著性差异。使用7d消毒剂梯度下，第三组（甲醛+过氧化氢）的发眼率极显著高于第五组（中草药+过氧化氢）和第六组（中草药+甲醛）；显著高于第二组（过氧化氢+中草药）。使用10d消毒剂A梯度下，第三组（甲醛+过氧化氢）和第四组（甲醛+中草药）的发眼率极显著或显著高于第五组（中草药+过氧化氢）和第六组（中草药+甲醛）；双侧T检验的结果显示：7d、10d情况下，A使用时长与发眼率显著相关。综合分析推测，虹鳟受精卵孵化前5d内为水霉预防关键期，过氧化氢、甲醛和中草药三种消毒剂的防御效果均较佳；5d后至发眼前，主要是水霉治疗期，三种消毒剂的效果不同，甲醛的效果好于其他两种。中草药后期的治疗效果较前期预防效果差，其主要原因是：本试验所用中草药为自制配方，成分仍有较大改进空间，且使用一般药品时，预防所用剂量小于治疗剂量，在后期治疗中适当加大使用剂量可改善治疗效果。5d与10d的发眼率无显著差异，表明在养殖过程中预防疾病重于治疗。

3.4 建议

本试验表明，过氧化氢、甲醛和中草药浸提液均可以显著提高虹鳟受精卵的发眼率。然而，前两种的使用剂量和频率均较高，既加大了生产成本，又加重了操作人员的工作量，对人体健康也不利。近年来中草药在水产动物疾病防治中的研究崛起，但中草药成分复杂，有效成分直接合成及大量生产难度很大。本研究首次将不同药物配合使用的，取得了较佳的效果。此方法在其他水产养殖动物疾病防治中已有使用，如将中草药提取物与硫酸铜等复合使用后可有效抑制水霉属和丝囊霉属的生长，提高了异育银鲫Carassius auratus gibelio和加州鲈Micropterus salmoides的出苗率[19]。建议在实际生产中，使用消毒剂与完善防疫体系并举[20]，建立一套科学、严格、有效的防疫体系，可大大减少消毒剂的使用量，真正达到安全、高效、价廉。

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