论文:鱼类诺卡氏菌病的研究进展

发表时间:2023/08/25 17:16:36  来源:水产养殖 2018年1期  浏览次数:2628  
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鱼类诺卡氏菌病的研究进展

朱志东 ,吕莉 ,邓剑壕 ,冯豆 ,许佳楠 ,蔡延渠 ,辛年香 ,朱盛山

(1.广东药科大学中药开发研究所,广东 广州 510006;2.广州普精生物科技有限公司,广东 广州 510006)

诺卡氏菌病(Nocardiosis)是由诺卡氏菌引起的一种人兽共患的慢性传染病。我国1980年首次报道了诺卡菌病例,截至目前已报道至少有13个省(直辖市、自治区)的人群中存在诺卡氏菌的感染[1]。诺卡氏菌病在水产养殖方面危害极大[2-3],在亚洲地区养殖鱼类中诺卡氏菌病频发,发病鱼种包括鰤[4-5]、鲳[6-8]、大黄鱼[9]、招财鱼[10]、罗非鱼[7]、乌鳢[11]、大口黑鲈[11]、石斑鱼[7]、四指马鲅[7]、紫红笛鲷[7]、红笛鲷[7]、六带鲹[7]等。随着养殖业集约化程度的提高,养殖过程中的疾病也日趋严重,鱼类诺卡氏菌病自然发病率可达到15%~30%,严重的达到60%,人工感染的病死率可高达90%~100%[12]。近年来鱼类诺卡氏菌病引起越来越多学者的广泛关注,抗生素治疗细菌感染性疾病难以根治,由于用药疗程长,长期使用抗生素容易产生耐药性,抗生素残留也会导致人体蓄积性中毒,而中药对人毒性低,不易引起细菌耐药性[13],在治疗鱼类诺卡氏菌病具有很大优势,如本课题组蔡延渠[18-19]论述用中草药抗胃肠道细菌感染和呼吸道细菌感染的疗效,发现中草药是临床治疗胃肠道细菌和呼吸道细菌感染的另一良好“替代抗生素”;如本课题组周泽琴[2]研究的中药复方NZ方抑菌性显著,对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌、创伤弧菌的最低抑菌浓度仅为0.313 mg/mL,如何有效防治诺卡氏菌病对鱼类养殖的侵袭也备受水产业界人士关注和重视。

鱼类诺卡氏菌病的致病菌主要是鰤鱼诺卡氏菌(N.seriolae)[14-17]、星状诺卡氏菌(N.Asteroides)[10],本文就鱼类诺卡氏菌病的流行环境、诊断方法以及防治手段等方面进行综述,希望为鱼类诺卡氏菌病的防治提供参考。

1 流行环境

鱼类诺卡氏菌病以水温在25~28℃时发病最为严重。该病流行季节较长,发病鱼常为1龄或2龄鱼,发病高峰主要集中在6—9月份。发病时鱼一般不吃食,环境变化后,尤其在雨后,发生死亡现象更加严重[12、23]。

2 诊断方法

2.1 主要症状

患病初期,反应迟钝,食欲下降,有时肛门红肿,体表无明显症状;患病中期,体表有损伤、溃烂,腹部膨胀等现象;患病晚期,背部、腹部和尾部体表损伤并溃烂出血,更有甚者体表形成脓肿或瘘管,随后逐渐死亡[20-22]。

2.2 解剖

王国良等[11]取浙江萧山患鰤鱼诺卡氏菌病的乌鳢解剖,膨大的腹腔内有少量透明或淡黄色液体,在肝、脾、肾等内脏组织中出现乳白色或淡黄色结节,直径0.1~0.5 cm。黄郁葱等[22]从湛江港、阳江闸坡取海水网箱养殖的患鰤鱼诺卡氏菌病的卵形鲳鲹进行解剖,肝、肾脏、脾脏充血并肿大,鳃、肝、肾脏、脾脏、鳔、肠系膜等有大量直径0.1~0.3 cm的白色结节。林伟等[10]取信阳市患星状诺卡氏菌病的招财鱼,解剖观察,有黄色腹水,肝、脾、肾明显肿大并有直径0.1~0.5 cm的白色结节。

鱼类诺卡氏菌病又称结节病,可在内脏各器官形成肉眼可见直径0.1~0.5 cm的大量白色结节,以脾脏和肾脏最为显著[24]。但除诺卡氏菌感染会引起鱼内脏器官出现白色结节外,杀鱼巴斯德氏菌、嗜水气单胞菌、哈维氏弧菌、恶臭假单胞菌、维罗纳气单胞菌等致病菌亦会导致鱼腹腔或内脏器官出现白色结节的症状,所以,发现患病鱼内脏出现白色结节症状,也不能就绝对的认为这是鱼类诺卡氏菌病[25-26]。

2.3 生物技术

王国良等[27]针对鰤鱼诺卡氏菌16S—23S rRNA基因内转录间隔序列,设计了四条LAMP引物,扩增后的产物经电泳后呈现特异性的LAMP梯形条带,建立LAMP法,对患病乌鳢、大黄鱼、黄姑鱼组织样品进行检测,发现鰤鱼诺卡氏菌DNA的LAMP扩增为阳性。蒋依依等[28]根据鰤鱼诺卡菌16S—23S转录间隔区(ITS)序列设计特异性引物,建立了鰤鱼诺卡氏菌特异性PCR快速检测方法,并对鰤鱼诺卡氏菌人工感染的大口黑鲈组织进行了检测,结果从大口黑鲈组织中检出阳性鰤鱼诺卡菌ITS序列扩增片段、阳性率100%,比传统细菌分离鉴定方法更加灵敏、快速且高效。王国良等[29]根据GenBank中鰤鱼诺卡氏菌16S—23S rRNA基因序列设计并合成一对特异性引物,经反应体系优化后建立了检测鱼诺卡氏菌的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,后提取患病大黄鱼DNA作SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测,鰤鱼诺卡氏菌DNA扩增为阳性,进而检测出大黄鱼鰤鱼诺卡氏菌病,为鱼类诺卡氏菌病的早期快速检测与防控提供有效的技术支持[31]。

3 防治

3.1 化学药

蒋依依等[30]取患病加州鲈体内分离鰤鱼诺卡氏菌,采用纸片扩散法测定其对10种抗生素的敏感性,该菌株对四环素和氯霉素高度敏感,抑菌圈直径为57 mm、48 mm;对磺胺类和氨苄青霉素最不敏感,抑菌圈直径都为0 mm。曹铮等[31]从患病乌鳢体内分离的鰤鱼诺卡氏菌,通过纸片扩散法研究其对14种常用抗生素的敏感性,发现该菌株对红霉素最敏感,抑菌圈直径分别为46 mm;对阿米卡星、新霉素、青霉素G、先锋V等耐药,抑菌圈直径分别为 14 mm、12 mm、0 mm、0 mm。林伟等[32]对发病招财鱼体内分离得到的星状诺卡氏菌,用纸片扩散法试验其对14种抗生素的药敏性,红霉素最敏感,抑菌圈直径达45 mm,其次为环丙沙星,抑菌圈直径为32 mm;对阿米卡星、新霉素、青霉素G、先锋V等耐药抑菌圈直径分别为13 mm、16 mm、0 mm、0 mm。

满其蒙等[33]研究用红霉素、恩诺沙星、氟苯尼考治疗卵形鲳鲹鰤鱼诺卡氏菌病的效果,人工腹腔注射感染后,对第1天投药和第4天投药的治疗情况进行比较,给药剂量20 mg/(kg·d),拌料投喂,连续投喂10天。结果显示,攻毒后第一天投药、攻毒后第4天投药及预防组治疗效果较好的分别是恩诺沙星、红霉素及氟苯尼考,其对卵形鲳鲹、鰤鱼诺卡氏菌感染的保护率分别为53.4%、30%及26.7%。孟思妤[34]用22.0 mg/kg鱼体质量的氨苄青霉素治疗,拌料后阴干投喂,每天投喂1次,连续投喂6 d,发现乌鳢的死亡数量只有十几条;用20.0 mg/kg鱼体质量的交沙霉素治疗,拌料后阴干投喂,每天投喂1次,连续投喂5 d后乌鳢死亡数量明显下降,但是,用药后第9天每天乌鳢死亡数量还有300尾以上。

3.2 生物药

解俊等[35]应用浓度为108CFU/mL的0.4%甲醛灭活鰤鱼诺卡氏菌对乌鳢进行腹腔注射,剂量为0.5 mL/尾,对照组同法等量注射灭菌生理盐水。分别在实验第 0、3、6、9、12、15、18、21 d 抽取乌鳢血液,测定其血细胞数、血清总蛋白含量及血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶、溶菌酶活性。与对照组相比,注射灭活鰤鱼诺卡氏菌后,乌鳢血细胞数呈先升高后降低的趋势,在实验第12天时注射组血细胞数显著高于对照组90.33×1010cell/L;血清总蛋白含量在实验第9天后均高于对照组且第9天的峰值比第21天大0.96金氏单位/100 mL;血清碱性磷酸酶、酸性磷酸酶、超氧化物歧化酶和溶菌酶等活性在实验时间内均有所增强。研究表明,灭活菌苗的刺激能引起乌醴血细胞的增殖以及血清中各非特异性免疫指标的变化,从而提高机体自身的免疫保护力。

3.3 中草药

目前,研究中药治疗诺卡氏菌病的较少。舒孝顺等[36]使用K-B纸片法测定菝葜水提物对诺卡氏菌等细菌的敏感性,发现菝葜水提物2 mg/片对诺卡氏菌敏感,抑菌圈直径为10.3 mm;进一步使用二倍稀释平皿法测定其对诺卡氏菌的MIC值,结果为2.08 g/mL。

4 讨论与总结

诺卡氏菌病潜伏期长,发病前期无症状或症状不明显,后期治愈率低,发病率高,发病病死率高,对鱼类危害大,给水产养殖产业带来严重危害。临床上,可根据鱼类诺卡氏菌病的流行特征及观察体表、鳃丝、腹腔和内脏的发病症状基本诊断该病。进一步判断要通过做细菌分离鉴定,确诊后再做药敏试验,这样才能对症用药,达到良好治疗效果[25]。水产动物致病性诺卡氏菌的生物检测技术已日益成熟,主要有PCR法和环介导恒温扩增技术法,通过DNA片段扩增为阳性,进而诊断鱼类诺卡氏菌病,为鱼类诺卡氏菌病的早期快速检测与防控提供有效的技术支持[29、37、39]。

目前对于鱼类诺卡氏菌病的防治仍以化学药物为主,如四环素、红霉素、环丙沙星、氟苯尼考等,但存在对水体环境和危害人体健康等问题,中华人民共和国农业部已将其列为水产养殖禁药,且当疾病发生后,一些敏感性抗生素也很难达到治疗效果,同时也存在阿米卡星、新霉素、青霉素G、先锋V等抗生素耐药的问题[31-32]。在生物药方面,水产动物诺卡氏菌病也进行了疫苗方面的研究,无论是灭活疫苗还是弱毒疫苗效果都很有限,还没有商品化疫苗可以使用[25、38]。迄今为止,尚未见到关于水产动物诺卡氏菌病中草药有效防治方面的报道,关于其抗菌的筛选方面的研究也很少[38、40]。

近年来,随着渔业养殖疾病的暴发越来越频繁,我国鱼类养殖业受病害肆虐情况严重,患鱼类诺卡氏菌病鱼的肝脏、肾脏等内脏器官损伤较大,治愈难度相当大,因此,对于该病的控制还是要“预防为主、防重于治”。此外,由于高效安全的渔药很匮乏,诺卡氏菌的致病机制仍然不清楚,导致难以彻底治愈诺卡氏菌病。笔者在研究中草药防治鱼类诺卡氏菌病中发现复方MY具有很好的效果,选取乌鳢(30~40 g)480条,鰤鱼诺卡氏菌(攻毒感染),后分成四组高剂量组、中剂量组、低剂量组、空白组养在10 m3的鱼缸中,6 d后当乌鳢体表溃烂出血,肛门红肿,解剖发现内脏(肾、脾、肝)白色结节增多等比较严重的症状后拌料进行给药。内脏白色结节镜检可见大量短杆状细菌,进一步分离鉴定为鰤鱼诺卡氏菌,结果:空白组全部死亡;复方MY高剂量组存活率100%;复方MY中剂量组存活率91%;复方MY低剂量组存活率42%,由此可见中药在防治鱼类诺卡氏菌病是具有一定的效果。相关研究显示,水产养殖用中草药不会有抗生素残留问题。笔者期望后续的研究者应加强中草药防治鱼类诺卡氏菌病的研究,尤其是新药的研发、中草药资源的开发,这将促进水产绿色养殖的发展。

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