虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

发表时间:2023/09/25 20:18:37  来源:水产养殖 2020年11期  浏览次数:5270  
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虾类肝肠胞虫流行病学研究进展

胡吉卉,李正民,段健诚,高焕

(1. 江苏海洋大学海洋科学与水产学院,江苏省海洋生物技术重点实验室;江苏 连云港 222005;2. 江苏省农业种质资源保护与利用平台,江苏 南京 210014)

虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei, EHP)隶属于微孢子虫科(Microsporidia)、肠胞虫属(Enterocytozoon),成熟的孢子大小为(0.9±0.3)μm×(1.8±0.3)μm,呈椭圆形[1-2]。2003 年在泰国养殖的斑节对虾(Penaeus monodon)中发现,2009 年被成功分离,并被定义为孢子虫属的一个新物种[3]。

肝肠胞虫作为一种专性细胞内寄生虫,主要寄生在虾类肝胰腺肝小管上皮细胞内,且具有高度传染性。凡纳滨对虾(P. vannamei)、脊尾白虾(Palaemon carincauda)和斑节对虾(P. monodon)等主要经济养殖虾类都是其主要感染对象,感染后会造成虾类生长缓慢或停滞,是影响全球虾类养殖生产的重要病原之一[4-5]。该文总结了国内外现有的研究成果,重点介绍了肝肠胞虫在流行情况、病理症状、致病机理、传播途径、检测方法和防治措施等方面的研究进展,以期为肝肠胞虫的病害防治提供指导帮助。

1 流行情况

自2003 年被发现以来,中国、印度、委内瑞拉、马来西亚、印度尼西亚等多个国家都有EHP 检出的相关报道[6]。从2013 年开始,我国多个省市的虾类养殖基地先后发现了EHP 感染,并且感染率呈上涨趋势。2015 年上半年,浙江省水产技术推广站检测了70 多个苗种场的134 份南美白对虾虾苗样品,结果发现EHP 的检出率达53.8%[7];同年5—9 月,舟山地区270 份凡纳滨对虾样本中,EHP 的检出率高达85.19%[8]。2015—2017 年天津市虾肝肠胞虫的流行情况调查显示,当地养殖虾类中存在不同程度的EHP 感染,2015 年和2016 年EHP 的检出率分别为56.96%、69.52%[9]。2019 年江苏省温室池塘养殖虾类中EHP 的患病率为56.3%,而土塘养殖虾类中EHP 的患病率则达到了79.5%[10]。由此可见,EHP 引发的感染病已经严重危害了我国虾类养殖业。

2 病理症状

EHP 会使养殖虾类感染肝胰腺微孢子虫病(Hepatopancreatic microsporidiosis, HPM),感染后没有明显的临床症状,摄食正常,肠道饱满,没有大批量死亡。2~3 个月后病虾表现为生长速度缓慢甚至停止生长,体型大小差异明显,约50%左右的染病虾体质量增长到4~5 g 时再无变化。严重感染时,病虾肠道出现发炎,解剖发现其肝胰腺萎缩病变、发软、颜色变深,少数病虾还会出现白便症状[11]。

取感染虾的血淋巴进行检测,发现其总蛋白量和白蛋白量显著上升,碱性磷酸酶(alkalinephos phatase, ALP)、谷草转氨酶(asparate transaminase,AST)和谷丙转氨酶(alanine transaminase, ALT)等肝损伤指标数值显著高于健康虾[12]。由此可知EHP会引起肝胰腺病变,从而导致肝胰腺功能受损。

3 感染机制

EHP 无法在细胞外进行繁殖,只能寄生在细胞内部,因此其感染方式也比较独特。目前普遍认为极管是EHP 感染宿主细胞的主要细胞器[13]。极管是以螺旋形盘绕在孢子内部的一种管状结构,由极管蛋白组成且具有弹性。当孢子进入宿主体内时,由于外界环境的刺激,孢子内部压力急剧增大,极管外翻并弹出,刺破宿主细胞膜,然后将孢原质注射进宿主细胞内部[14]。孢原质在新的细胞中增殖循环,最终产生新的孢子,从而实现孢子的繁殖和遗传物质的复制[15]。

4 传播途径

传播是寄生虫感染宿主群体并完成生活史的重要环节之一。EHP 的传播有两种途径:水平传播和垂直传播。

4.1 水平传播

大多数微孢子虫都具有致病性,且大多通过水平传播方式感染脊椎和无脊椎宿主[16]。EHP 的水平传播途径相对复杂,既可以通过摄食传播,即健康虾摄食被EHP 污染的饲料或饵料、病死虾残体以及养殖水环境中的孢子体而被感染[17];也可以通过养殖水体传播,即健康虾生活在含有EHP 孢子的养殖水体中被感染[18]。

4.2 垂直传播

垂直传播是指EHP 通过母体宿主传递到子代宿主,通过宿主的繁殖实现自身传播。2018 年Vukhac等[19]给亲虾投喂已感染的虾组织,在无节幼体中发现了EHP 的感染,第一次证明EHP 可以在凡纳滨虾类中垂直传播,并根据这个结果建立了一种针对虾类幼体EHP 检测的PCR 方法。

5 检测方法

EHP 的检测有多种方法,显微镜技术、细胞培养方法、动物模型等方法都可检测到[20]。但由于EHP个体微小,光学显微镜观察虫体形态的方法很难直接判断,因此常采用组织学或分子生物学方法来对EHP 进行确切的诊断。

5.1 组织学方法

病理检测是目前临床医学最为可靠的一种定性诊断,可通过组织石蜡切片,苏木精-伊红(HE)染色,显微观察,最终发现组织病理变化,准确判断病因[21]。目前常用的组织染色法有HE 染色法、甲苯胺蓝(TB)染色法、Masson 染色法、普鲁士蓝(PB)染色法、爱显蓝-雪夫(AB-PAS)染色法、伟郝夫范吉森(EVG)染色法、劳克坚牢蓝(LFB)染色法和天狼猩红(Sirius red)染色等[1]。常晓晴等[21]对以上8 种染色方法进行比较,综合分析染色效果及检出率,发现Masson 染色法效果最佳。然而,组织学方法检验耗时长,制作流程繁琐,且肝肠胞虫含量低时极易漏诊,因此,现在主要将其用作临床诊断的辅助工具。

5.2 分子生物学方法

与组织学方法相比,分子生物学方法更灵敏、更快速、特异性更强,是目前实验室检测EHP 最常使用的技术手段。目前常用的分子生物学方法主要有普通PCR 检测法、环介导等温扩增技术(Loopmediated isothermal amplification, LAMP)、地高辛标记核酸探针原位杂交法、巢式PCR、实时荧光定量PCR 法等,这些方法在快捷程度和灵敏度上各有优劣。

5.2.1 环介导等温扩增技术 环介导等温扩增技术是一种新型核酸扩增技术,具有特异性强、敏感性高、成本低廉的优点。因其操作简单、检测速度快,常用于现场的快速检测。孙妍等[22]比较了LAMP方法和常规PCR 方法在检测EHP 灵敏度方面的差异,发现该方法检出限为3.71 个质粒拷贝/μL,灵敏度是普通PCR 的100 倍。

5.2.2 原位杂交技术(ISH) ISH 是一种比PCR 法灵敏度更高,且可以定位和相对定量检测EHP 的方法。该方法利用核酸分子单链之间互补的碱基序列,将探针与待测DNA 或RNA 结合成专一的核酸杂交分子,经一定手段将其显现出来[23]。Tang 等[24]采用该方法特异性的检出了凡纳滨对虾组织、粪便和养殖水体中存在的EHP。不足的是该方法操作繁琐且费时。

5.2.3 PCR 检测法 普通PCR 方法只进行一次特异性片段的扩增,容易出现假阳性,因此很难准确的判断EHP 感染[25]。巢式PCR 作为一种变异的聚合酶链反应,通过两轮PCR 反应,增强了检测的特异性和敏感度。Amornrat 等[17]扩增了EHP SSU rDNA 基因并且构建了系统进化树,建立了EHP 的一种巢式PCR 检测方法,证明了EHP 不是凡纳滨对虾白便综合征的原因。Jaroenlak 等[25]针对EHP 的胞外蛋白基因进行了鉴定和基因组测序,并以此建立了一种新的巢式PCR 检测方法,即灵敏度更高的SWP-PCR 法。

实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是利用荧光信号的积累实时监测PCR 进程,然后对未知模板进行定量分析的检测方法。目前已建立的实时荧光定量PCR 方法根据使用所使用的荧光物质不同分为TaqMan 探针法和SYBR Green I 荧光染料法两种,更常用的是操作简单且成本低的SYBR Green I 荧光染料法。骆云慧等[26]建立了灵敏度比常规PCR 高10 倍的TaqMan 实时荧光定量PCR 检测方法,该方法对EHP 标准质粒的检测灵敏度为5.2×102copies/μL,可满足高通量检测。刘珍等[5]优化了荧光定量PCR 反应条件,建立了检测灵敏度比普通巢式PCR 高约4 倍的SYBR Green I 实时荧光定量PCR 检测方法。该方法简单快速且灵敏度高,避免了因样品的代表性和灵敏度而造成的误诊问题。

6 防治措施

EHP 的出现,严重危害着虾类养殖,国内外学者也对其防治措施进行了大量的研究。但由于EHP的严格细胞寄生,其成熟的孢子壁有一层极坚硬的几丁质外壳,外源性药物很难见效,目前还未发现有效的治疗药物[27]。因此对于EHP 的防治应“防重于治,防治结合”双管齐下,根据实际情况,对养殖过程中的每一个可能感染EHP 的环节做好风险防控,多方面实施预防手段,进而减少EHP 的感染。

6.1 严格的清塘处理

有机质丰富的池塘会给EHP 的中间宿主提供适宜的生存环境,因此在放苗前,要对池塘进行彻底的清塘处理,尤其是曾经感染过EHP 的养殖池溏。处理方式包括对池塘底泥进行翻耕,并用氢氧化钠、生石灰等强碱性物质对塘底消毒,从而破坏大部分微孢子虫适宜的生存环境,排除虾EHP 存在的隐患[20]。

6.2 育苗生物安全

选择优质的虾苗进行繁殖和培育,繁殖前要进行严格且正规的检测。培育亲虾的培育池及日常养殖使用的工具,在正式使用之前要确保清洁干净。做好池塘的清淤消毒,之后还要进行干燥处理。以上措施虽不能完全消灭EHP,但可以降低EHP 的数量水平。

6.3 加强池塘管理

池塘水质的稳定对于虾类的养殖尤为重要,因此要对池塘进行严格的管理。应主要从以下几个方面加强管理:①要及时捞出病虾、死虾,防止健康虾残食;②及时清理虾的排泄物和代谢产物,避免污染水质,导致进一步的交叉污染;③可以在饲料中添加一些保肝护肠道的产品,改善虾的体质,防止寄生虫感染肠道;④虾类养殖用水在使用前,需经过蓄水池沉淀、砂滤、曝气、消毒等处理;养殖过程中产生的废水,必须要经过科学处理后,排放到指定的地点,防止扩大污染;⑤要根据实际养殖情况对池塘定期换水,必要时可向池中添加一些水质净化剂[28]。⑥降低池水盐度一定程度上可预防虾EHP的传播。

7 展望

虾类养殖集约化是未来发展大势所趋,但高密度养殖却加快了疾病的流行和传播。目前EHP 对我国虾类养殖已造成了不可估量的危害,但其生活史、与宿主之间的联系以及孢子萌发机制等问题都没有得到完全的解决。因此,在未来的研究工作中,应加强虾类养殖环境的保护与治理,加快优质虾类苗种的繁育工作,改进EHP 检测和预防技术,并尽快研制治疗EHP 的有效药物,以保障虾类养殖的健康发展。

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