罗非鱼具有生长迅速、养殖周期短、食性广、饵料要求低、病害少、对环境的适应性较强、群体繁殖力强［１］的特点，是水产养殖中重要的淡水经济鱼类之一［２－３］。水生生物在适宜温度范围内，依靠自身生理生化补偿机制适应环境温度变化，但是在超出适宜范围时，机体补偿能力下降［４］。罗非鱼的适宜生存温度为１６～３８℃，当水温过低时，罗非鱼会昏迷甚至死亡，这将严重影响罗非鱼的越冬。关于温度对罗非鱼影响的研究较多。马旦梅等［５－６］研究了罗非鱼对不同低温胁迫及其持续期的耐受性和罗非鱼对不同降温速率胁迫的死亡反应。郭先霞等［７］研 究 了 罗 非 鱼 对 低 温 的 抗 逆 性。Ｌｉ等［８］研 究 了 中 国３种 尼 罗 罗 非 鱼 （Ｏｒｅｏｃｈｒｏｍｉｓｎｉｌｏｔｉｃｕｓ）的耐寒性。Ｊｅａｎｅｔｔｅ等［９］研究了环境温度对莫桑比克罗非鱼（Ｏ．ｍｏｓｓａｍｂｉｃｕｓ）的渗透调节能力、有机渗透因子及血浆激素的影响。Ｅｔｉｅｎｎｅ等［１０］研究了水温对尼罗罗非鱼的生存、生长及表型性别的影响。Ｄｉｅｇａｎｅ等［１１］研究了低温和高温下，莫桑比克罗非鱼的免疫反应及其对链球菌（Ｓｔｒｅｐ－ｃｏｃｃｕｓ）的敏感性。关于低温影响罗非鱼生命活动的机制和低温导致罗非鱼体内各种生理生化指标变化的研究目前鲜见报道。本试验测定３个不同低温条件下尼罗罗非鱼的总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素、总胆固醇和甘油三酯、血糖、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶、谷草转氨酶等生化指标，脾脏指数、溶菌酶等免疫指标和脾脏的总抗氧化力、过氧化物酶、过氧化氢酶、黄嘌呤氧化酶和总超氧化物歧化酶等抗氧化指标，从生化指标、免疫指标及抗氧化等方面系统研究低温对罗非鱼生命活动的影响，探讨低温下罗非鱼昏迷与死亡的机制。

１　材料与方法

１．１　材料

９０日龄健康埃及尼罗罗非鱼，雌雄各半（雌鱼腹部的臀鳍前方有３个孔，即肛门、生殖孔和泌尿孔，３孔并为一体，统称为泌尿生殖孔；雄鱼的泌尿生殖孔内只有两个开孔，即肛门和泄殖孔），规格整齐，来自国家级广西南宁罗非鱼良种场。试验前先于暂养池中暂养７ｄ，投喂广东凤凰有限公司的普通饲料。

１．２　试验方法

将６４尾罗非鱼平均分为４组，每组１６尾，雌雄各半，放入４组运行正常的水族箱中。随机选取一组作为对照组Ｔ２０，温度维持２０ ℃，其余３组作为试验组Ｔ１６、Ｔ１２、Ｔ１０，按照１ ℃／６ｈ的降温速度由２０℃分别降至１６、１２、１０ ℃。当每组温度分别降至最终温度时维持１２ｈ，然后进行样本的采集。

１．３　样本的采集及处理

从每组随机选取８尾罗非鱼（雌雄各半），取血液（用于制取血浆）与脾脏（用于制取脾脏匀浆）。称量质量后快速将罗非鱼从水中捞起，用湿纱布将头部蒙住，用１０％乙二胺四乙酸二钠溶液浸润的２ｍＬ无菌注射器，由尾窦抽血，将血液注入２ｍＬ的离心管中，放入４℃冰箱过夜。翌日３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，制取血浆，分装后－８０℃保存。将抽完血的鱼剖开，取出脾脏，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称量质量并记录，放入５ｍＬ的小烧杯内。用量筒量取组织质量１９倍体积的０．８６％冷生理盐水，用移液器取总量２／３的冷生理盐水于烧杯中，用眼科小剪尽快剪碎组织块，将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的１／３匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一并倒入匀浆管中匀浆，左手持匀浆管将下端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（６～８ｍｉｎ），充分研碎，使组织匀浆化。将制备好的混合液５％匀浆，３０００ｒ／ｍｉｎ离心１５ｍｉｎ，取上清液分装，－８０℃保存备用。

１．４　生化指标的测定

将部分血浆送至瑞康医院检测总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素、总胆固醇和甘油三酯指标。血糖、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按说明书操作。

１．５　免疫指标的测定

溶菌酶采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按说明书操作。脾脏指数（ｍｇ／ｇ）＝脾脏质量（ｍｇ）／质量（ｇ）

１．６　抗氧化指标的测定

考马斯亮兰蛋白、总抗氧化力、过氧化物酶、过氧化氢酶、黄嘌呤氧化酶和总超氧化物歧化酶采用南京建成生物工程研究所的试剂盒，按说明书进行操作。１．７　数据处理所有试验数据用ＳＰＳＳ　１７．０软件统计处理，进行单因素方差分析和ＬＳＤ多重比较，数据用平均值±标准差表示。Ｐ ＜０．０５为差异显著，Ｐ ＜０．０１为差异极显著，Ｐ ＞０．０５为差异不显著。

２　结果与分析

２．１　低温对罗非鱼生化指标的影响

１６℃时，血清中总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素含量最低（表１）。其中Ｔ１６和Ｔ１２的总蛋白相对于对照组极显著下降（Ｐ ＜ ０．０１），Ｔ１０的总蛋白相对于对照组显著下降（Ｐ ＜０．０５），且３个试验组之间无显著差异（Ｐ ＞０．０５）；３个试验组的白蛋白相对于对照组均极显著下降（Ｐ ＜０．０１），且３个试验组之间无显著差异（Ｐ ＞ ０．０５）；Ｔ１６和Ｔ１２的球蛋白相对于对照组均显著下降（Ｐ ＜０．０５），但是Ｔ１０的球蛋白与对照组差异不显著（Ｐ ＞ ０．０５）；Ｔ１２的尿素相对于Ｔ１６和对照组显著上升（Ｐ ＜０．０５），Ｔ１０的尿素相对于Ｔ１６和对照组极显著上升（Ｐ ＜０．０１），但Ｔ１６和对照组之间差异不显著（Ｐ ＞ ０．０５），Ｔ１２和Ｔ１０之间差异也不显著（Ｐ ＞０．０５）。Ｔ１６和Ｔ１０的总胆固醇相对于对照组的极显著下降（Ｐ＜０．０１），Ｔ１２的总胆固醇相对于对照组显著下降（Ｐ＜０．０５），但是３个试验组之间差异不显著（Ｐ＞０．０５）。Ｔ１０的甘油三酯相对于对照组显著下降（Ｐ＜０．０５），Ｔ１６、Ｔ１２和对照组之间差异均不显著（Ｐ＞０．０５），３个 试 验 组 之 间 的 差 异 也 不 显 著 （Ｐ ＞０．０５）。Ｔ１２的血糖相对于Ｔ１６和对照组极显著上升（Ｐ＜０．０１），Ｔ１０相对于Ｔ１６和对照组也极显著上升（Ｐ＜０．０１）。温度对酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、谷丙转氨酶和谷草转氨酶的影响不显著（Ｐ＞０．０５）。

２．２　低温对罗非鱼免疫指标的影响

Ｔ１２的脾脏指数最高，Ｔ１０的脾脏指数相对于Ｔ１２的显著下降（Ｐ ＜０．０５），但Ｔ１６、Ｔ１２与对照组间差异均不显著（Ｐ ＞０．０５）。低温对溶菌酶的影响不显著（Ｐ ＞０．０５）（表２）。

２．３　低温对罗非鱼脾脏抗氧化指标的影响

Ｔ１６的总抗氧化力水平最高，但与对照组差异不显著（Ｐ ＞０．０５），Ｔ１２水平最低，且相对于对照组和Ｔ１６差异极显著（Ｐ ＜ ０．０１），Ｔ１０水平与对照组无显著性差异（Ｐ ＞０．０５）（表３）。Ｔ１６和Ｔ１２的黄嘌呤氧化酶活性相对于对照组显著下降（Ｐ ＜０．０５），而Ｔ１０相对于对照组的极显著下降（Ｐ ＜０．０１），但３个试验组之间差异不显著（Ｐ ＞０．０５）。Ｔ１６的过氧化物酶活性水平最高，与对照组差异显著（Ｐ ＜０．０５），Ｔ１０水平最低，但是与对照组、Ｔ１６和Ｔ１２差异均不显著（Ｐ ＞０．０５）。Ｔ１０的过氧化氢酶活性水平最低，与对照组差异显著（Ｐ ＜０．０５），但是３个试验组间差异不显著（Ｐ ＞０．０５），对照组、Ｔ１６和Ｔ１２之间差异也不显著（Ｐ ＞０．０５）。Ｔ１２的总超氧化物歧化酶活性水平最低，但与对照组差异不显著（Ｐ ＞０．０５），Ｔ１０的水平最高，且与对照组差异显著（Ｐ ＜ ０．０５），而对照组、Ｔ１６和Ｔ１２之间差异不显著（Ｐ ＞０．０５）。

３　讨论

３．１　低温对罗非鱼生化指标的影响

总蛋白由白蛋白和球蛋白组成。血中白蛋白作为营养物质载体，维持血浆渗透压，为机体蛋白质来源，用于修补组织和提供能量；血中球蛋白来源于浆细胞的分泌，反映机体的抵抗力［１２］。在试验中，总蛋白、白蛋白和球蛋白均在１６℃时达最低水平，这是因为１６℃是一个过渡性的敏感温度，罗非鱼减少甚至停止摄食，影响体内氨基酸的合成，总蛋白、白蛋白和球蛋白含量下降。Ｔ１２和Ｔ１０的总蛋白、白蛋白含量相对于Ｔ１６有所回升，但变化不显著，这是机体对低温作出的适应性反应；而Ｔ１０的球蛋白含量相对于对照组的差异不显著，说明其含量恢复到正常水平，这是因为随着温度的降低，机体的浆细胞分泌了更多的球蛋白以增强机体的抵抗能力，对抗低温对机体带来的损伤。尿素是蛋白质的代谢产物，Ｔ１２的尿素相对于Ｔ１６和对照组显著上升，而Ｔ１０的尿素相对于Ｔ１６和对照组极显著上升。这可能是因为低温下，罗非鱼的肾脏出现损伤，尿素代谢不正常，血清尿素水平上升。崔学升等［１３］发现，在应激条件下，齐口裂腹鱼（Ｓｃｈｉｚｏｔｈｏｒａｘ　ｐｒｅｎａｎｔｉ）总胆固醇和甘油三酯含量明显下降。在试验中，Ｔ１６和Ｔ１０的总胆固醇含量都极显著低于对照组，而Ｔ１２的总胆固醇含量也显著低于对照组，Ｔ１０的甘油三酯含量显著低于对照组。这是由于随着温度的降低，一方面罗非鱼减少甚至停止摄食，使得外源获得的总胆固醇和甘油三酯减少甚至消失；另一方面，摄食的减少或停止，使能量供应不足，机体为了对抗低温，维持基本生命活动，会将部分甘油三酯分解成三磷酸腺苷来满足机体的需要，部分转化成糖类，提高血糖浓度，转变为非必需氨基酸用于合成蛋白质［６］；另外，温度过低，也会影响总胆固醇和甘油三酯的合成，三个方面一起作用从而使得两者浓度下降。在热应激的状态下，齐口裂腹鱼血糖浓度比对照组高７８．２９％，机体为抵抗热应激，会加快糖的利用，糖异生作用加强，提高血糖浓度。与此相类似，本次试验中，Ｔ１２和Ｔ１０的血糖相对于对照组极显著上升，相对于Ｔ１６也极显著上升。这是由于机体为应对冷应激而作出的适应性变化，通过各种转化作用提高血糖浓度，以供机体在低温下新陈代谢的需要。

３．２　低温对罗非鱼脾脏指数的影响

脾脏是免疫细胞发育和产生免疫效应物质及免疫力的场所，能合成增强吞噬细胞作用特有的物质，激活、增强巨噬细胞及中性粒细胞的吞噬和清异作用，可用于评价机体的非特异性免疫水平［１４］。本试验中，Ｔ１２的脾脏指数最高，但与对照组差异不显著，可能是因为在１２℃的低温下，为了应对低温应激，脾脏中的淋巴细胞增多；而Ｔ１０脾脏指数相对于Ｔ１２显著下降，但相对于对照组差异不显著，说明在１０℃时机体的非特异性免疫仍处于正常水平。

３．３　低温对罗非鱼抗氧化力指标的影响

机体在进行生理活动时都会产生一定量的自由基，正常情况下，自由基的产生与消除处于平衡状态。自由基的消除通过一系列的抗氧化物质，如过氧化物酶、过氧化氢酶和超氧化物歧化酶等保护性酶。如果机体自由基过剩时，就会出现一系列的生物毒性反应［１５］。仅Ｔ１２的脾脏总抗氧化力水平显著低于对照组与Ｔ１６，这可能是在１２ ℃时，脾脏中与抗氧化相关的酶活性较低，尚未适应低温环境。但是Ｔ１０脾脏总抗氧化力相对于对照组则无明显变化，说明机体脾脏抗氧化功能恢复正常水平。这可能是因为在低温胁迫下，脾脏仍然在产生自由基，但自由基要处于一种平衡状态，总抗氧化力水平就要调整到能与之相对抗的水平，否则脾脏功能就会出现紊乱，导致损伤或疾病。黄嘌呤氧化酶催化黄嘌呤或次黄嘌呤将单电子或双电子给予Ｏ２的方式氧化为尿酸，同时产生活性氧［１６］，是体内活性氧的重要来源［１７］。试验中，Ｔ１６和Ｔ１２的黄嘌呤氧化酶活性水平相对于对照组显著下降，而Ｔ１０的相对于对照组的极显著下降，这可能是由于温度下降导致脾脏中黄嘌呤氧化酶活性下降，产生的活性氧减少。过氧化物酶是一种起保护作用的诱导性酶，能利用水分子氧化供氢体，反映生物体产生和消除自由基能力及细胞代谢强度［１８］。试验中，Ｔ１６的过氧化物酶最高，且与对照组相比差异显著，而Ｔ１２和Ｔ１０的过氧化物酶相对于Ｔ１６虽然有所下降，但是相对于对照组变化不显著，其水平也维持在正常水平，说明过氧化物酶也是低温下机体对抗自由基的保护酶之一。过氧化氢酶是一种含铁卟啉的酶，能催化过氧化氢分解成氧和水［１９］。试验中，Ｔ１６和Ｔ１２的过氧化氢酶相对于对照组变化均不显著，但Ｔ１０过氧化氢酶相对于对照组、Ｔ１６和Ｔ１２显著下降，说明在１０℃时，过氧化氢酶的活性下降，可能是因为其不能适应这种低温所致。

叶亚新等［２０］发现，随着胁迫温度的降低，小麦、玉米、萝卜幼苗的超氧化物歧化酶活性在一定温度范围内都呈上升趋势。本试验中Ｔ１０的总超氧化物歧化酶相对于对照组显著上升，说明在１０ ℃时其水平超常。这是因为当动植物处于低温等逆境下，体内积累大量有害物质超氧阴离子，引起超氧化物歧化酶活力的迅速增强［１３］。

试验结果表明，低温可导致罗非鱼血液中总蛋白、白蛋白、球蛋白、尿素、总胆固醇、甘油三酯水平和脾脏指数降低及脾脏总抗氧化力、黄嘌呤氧化酶、过氧化氢酶活性降低，而脾脏过氧化物酶、总超氧化物歧化酶活性升高；低温时罗非鱼血液中尿素水平和血糖含量升高。当温度降至一定程度时，罗非鱼会出现昏迷，甚至死亡的现象，可能是由于机体内一些对机体有害物质的积累（如尿素等）和一些对机体有保护作用的物质浓度或活性降低（如白蛋白、球蛋白和过氧化氢酶等）所致。