虾类9种病毒性疾病及其防治
1.白斑综合征
俗称白斑病,是对虾的严重传染性疫病,20世纪90年代以来一直严重威胁着全世界对虾的养殖安全。该病的特点是感染率高、发病急、死亡率高、死亡速度快。病虾活力弱,部分濒死虾头胸甲部位出现白色斑点,白斑综合征因此而得名,但亦可不出现白斑而虾体变红。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为一类动物疫病,OIE将其列为必须申报的疾病。
【病原体】白斑综合征病毒(Whitespot syndromevirus,WSSV)。
【流行与危害】20世纪90年代初,该病首先出现于日本及我国台湾、广东、福建等地,随后扩散并遍及亚洲主要对虾养殖国家和地区。几年后蔓延到南北美洲,造成全球性的对虾养殖业损失。一般虾池发病后2~3天,最多不足1周时间可致全池死亡。
白斑综合征病毒的宿主范围非常广泛。已知40多种对虾和非对虾甲壳动物可感染该病毒,其中中国明对虾最为易感,其他可被感染致病或成为病毒携带者的对虾科生物有:斑节对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾、墨吉对虾、长毛对虾、印度对虾、桃红对虾、细角对虾、白对虾、褐对虾、刀额新对虾等。另外,罗氏沼虾、海南沼虾、埃氏沼虾、蓝氏沼虾、脊尾白虾、鼓虾、克氏原螯虾、哈氏美人虾、龙虾、虾蛄、三疣梭子蟹、锯缘青蟹、中华绒螯蟹、天津厚蟹、肉球近方蟹、日本大眼蟹、鲎等甲壳类动物等也可被感染。
在自然感染过程中,经口和鳃感染是传播的主要途径,对虾在幼体期易经口和鳃感染从而使虾苗携带病毒。此外,发病对虾精巢、精荚、卵巢中都能检测到病毒,因此受精卵可被污染从而造成垂直传播。由于多种甲壳动物都可携带该病毒,自然环境中病毒极易在动物个体间进行传播,使白斑病的防治工作变得较为困难。
【症状及病理变化】发病虾厌食,空胃,行动迟缓,弹跳无力,静卧不动或在水面兜圈。头胸甲易剥离,壳与真皮分离,部分患病对虾在头胸和最后的尾节甲壳内侧可见白色斑点;患病中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾体色发红,而患病斑节对虾在濒临死亡时则显示变蓝现象。血淋巴混浊、不凝固,血淋巴细胞减少。甲壳上白斑的主要成分是碳酸钙,是由于白斑综合征病毒在上皮细胞内的迅速增殖导致钙、磷比显著增高,使甲壳上形成了碳酸钙的沉积。
病毒侵害的主要组织和器官是甲壳下上皮组织、胃及后肠上皮组织、结缔组织、触角腺、造血组织、鳃、血淋巴器官。胃部坏死最严重,肝胰腺实质细胞、中肠上皮细胞、肌纤维细胞不被感染。
感染早期,被侵害组织的少量细胞核略微膨大,核中出现嗜酸性着色区域,核仁边移;随着感染时间延续,细胞核内嗜酸性着色很快转变为大的嗜碱性包涵体,使细胞核显著膨大,染色质只在细胞核边沿隐约可见,大量细胞被侵染。
病毒粒子在细胞核中复制和装配,成熟病毒粒子聚集于细胞核中,最后细胞解体,病毒粒子再感染周围细胞。在肌纤维之间的结缔组织及肝胰腺血窦的血细胞中也可见到病毒粒子。甲壳内面的白点在显微镜下可见呈重瓣的花朵状,外围较透明,花纹较清楚,中部不透明。
【诊断方法】在本病严重暴发流行时,可根据其发病史、临床特征及病理特征作出初步诊断,最后确诊需要通过实验室检查。诊断时应注意与桃拉综合征、细菌性白斑病相区别。本病的实验室诊断方法主要是通过采集急性病例的鳃、胃、附肢或其他上皮组织,进行下列检查。
(1)样品采集采集150尾虾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中对虾幼体、仔虾取完整个体,幼虾和成虾取虾的头胸部,非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1~0.5g。
样品采集的要求参照SC/T7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分:压片显微镜检查法)》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(2)组织及病理学检查
①新鲜组织的快速染色法:取新鲜的虾组织做成涂片,用“台盼蓝-伊红”染色法(T-E染色法)染色后,检查受感染细胞的典型变化。该方法适用于在现场或诊断实验室对患病濒死的对虾仔虾、幼虾或成虾进行快速诊断。
②组织病理学诊断:经HE染色后可清晰地观察到各种不同组织结构的病理变化。HE染色适用于发病对虾或其他敏感宿主的初步诊断和对怀疑染病宿主的诊断,不适于非感染性携带病毒样品的病毒检测。
③电镜诊断:电镜切片可在病虾鳃、胃、淋巴器官、皮下组织等的细胞核内观察到病毒粒子,通过提纯负染,电镜下可观察到完整的病毒粒子或无囊膜的核衣壳从而进行确诊。
(3)病原学鉴定
①生物诊断法:该法采用白斑综合征病毒指示器-SPF凡纳滨对虾幼虾进行试验。将采集的可疑虾附肢或虾头尖与TN缓冲液混合匀浆,离心上清液用2%无菌生理盐水按1:10的比例稀释,对指示虾进行肌内注射(IM),然后进行临床观察和组织病理学诊断。
②核酸探针检测法:采用白斑综合征病毒特异性的非放射性的地高辛标记探针进行,敏感性高于传统的病理组织学诊断法。核酸探针斑点杂交检测法适用于对虾的成虾、幼虾、仔虾、幼体和受精卵的活体、冰鲜或冰冻产品和其他甲壳动物感染病毒的筛查、临床病症的确诊。
③PCR检测法:通过聚合酶链式反应,检测病毒的特定基因。适用于对虾各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品以及其他非生物样品中WSSV的定性检测,具有高灵敏度和高特异性,适用于病原筛查和疾病确诊。
④单克隆抗体检测法:应用特异性的病毒单克隆抗体,采用斑点免疫印迹、免疫荧光和ELISA等方法进行诊断。
【防治方法】
(1)预防选择健康虾作为亲虾,培养健康虾苗。受精卵用含氯漂粉精或碘伏(聚乙烯砒咯烷酮碘)浸洗或用过滤海水并经紫外线消毒后冲洗5分钟。育苗用水应过滤和消毒,育苗期间切忌温度过高和滥用药物。
做好养殖池塘的清淤、消毒及培水工作。虾池在养虾前尽可能彻底清淤,然后进行消毒。用生石灰或含氯消毒剂均匀泼洒全池,消毒后应曝晒1周左右,然后进水。养殖过程中合理用水、培好水色、保持优良水质。在养虾场附近有虾病流行时,停止从海区向蓄水池注水,应将虾池中的水与蓄水池中的水循环使用。养虾池中适当混养一些摄食浮游生物或底栖藻类的鱼或贝类,有利于防止水质过肥,起净化水质的作用。
放养密度要合理。对虾的放养密度应根据当地水源、海域环境、虾池的结构和设备、生产技术、管理经验、虾苗的规格、饲料的质和量等条件而定。饲养管理过程中要注意水质及各种理化因子的变化,保持水体的相对稳定;坚持巡塘,定期检查,正确诊断,积极预防。在养虾池中接种和培养光合细菌净化水质,投喂能提高对虾细胞免疫力的中草药和免疫促进剂,也是目前常用的防治途径之一。
(2)控制对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫、掌握流行病学情况。可通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病。
(3)处理苗种繁殖场内WSSV检疫呈阳性的亲虾和苗种应全部扑杀;病毒阳性的种用和商品养殖虾必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。
2.桃拉综合征
俗称“红尾病”,是一种严重传染性对虾疾病,急性期以虾体变红(虾红素增多)、软壳,过渡期以角质上皮不规则黑化为特征。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。
【病原体】桃拉综合征病毒(Taura syndromevirus,TSV)。
【流行与危害】该病主要侵害凡纳滨对虾和细角对虾,对虾科滨对虾属所有成员均对本病易感,中国明对虾也对本病易感;凡纳滨对虾除卵、受精卵和虾蚴外,仔虾、幼虾及成虾等各期均对本病易感,主要感染14~40日龄、体重0.05~5g以下的仔虾,部分稚虾或成虾也容易被感染。对虾科其他属成员经直接攻毒也可感染,但一般不表现症状。细角对虾选择系对TSV(基因1型或A抗原型)有抵抗力。
其他已报道TSV的自然感染或试验感染宿主有白对虾、南方对虾、斑节对虾、刀额新对虾、中国明对虾、日本囊对虾、褐对虾和桃红对虾。
目前,本病广泛流行于美洲和东南亚对虾养殖区。该病1992年首次发现于厄瓜多尔桃拉河地区,之后随染疫仔虾和亲虾贸易迅速传播到厄瓜多尔、秘鲁、哥伦比亚、洪都拉斯、危地马拉、萨尔瓦多、巴西、尼加拉瓜、伯利兹、墨西哥、美国等美洲各大虾类养殖区。1999年中国台北从中南美洲进口凡纳滨对虾而传人本病,此后,随亲虾和仔虾的贸易传播到中国大陆、泰国、马来西亚、印度尼西亚等地。
该病发病急,死亡率高。一般发病虾池自发现病虾至对虾拒食人工饲料仅5~7天,10天左右大部分对虾死亡。部分虾池采取积极消毒措施后转为慢性病,逐日死亡,至养成收获时成活率一般不超过20%。本病主要通过健康虾摄食病虾、带病毒水源等方式水平传播;也可经海鸥等海鸟、划蝽科类水生昆虫携带病毒传播。携带病毒亲虾也可能经垂直途径传播到后代,但目前尚无可靠证据。持续感染虾和终生带毒虾是传染源;染疫存活凡纳滨对虾和细角对虾可终生带毒成为疾病传播者。
【症状及病理变化】
(1)症状根据病程和症状,桃拉综合征可分为急性期、过渡(恢复)期和慢性期3个阶段。
①急性期:虾红素增多,虾体全身呈淡红色,尾扇和游泳足呈鲜红色,因此虾民称之为“红尾病”。取尾扇发红的病虾,用10倍放大镜仔细观察细小附肢(如末端尾肢或腹肢)的表皮上皮,可以看到病灶处的上皮坏死。急性感染虾常死于蜕皮期间,处于脱壳后期的病虾以软壳、空腹为特征,濒死虾常浮于水面或池体边缘。
②过渡(恢复)期:介于急性期与慢性期之间,病程极短,以病虾角质层上皮多处出现不规则黑色斑点为特征。在过渡期,典型的急性期表皮损伤在数量和严重程度上都有所减少或降低,病灶坏死处聚集了大量血细胞及其渗出物。大量血细胞随后开始黑化,进而导致病虾角质层上皮呈现不规则的黑色斑点。
③慢性期:成功蜕皮的病虾,从过渡期转入慢性期,一般无明显的临床症状,但对正常的环境应激(如突然降低盐度)明显不如未染疫虾。有的因病毒在淋巴器官持续感染而成为终生带毒者。
(2)病理特征
①急性期:全身角质层上皮、附肢、鳃、后肠、前肠(食管、前后胃室)可见多灶性坏死;有时在角质层皮下结缔组织细胞,以及靠近感染角质层上皮的条纹肌纤维基质也可见感染灶。严重的病例,触角腺管状上皮也遭破坏。多灶性表皮坏死的典型症状包括多个感染细胞聚集在一起、细胞质嗜酸性增加、细胞核固缩或崩解。
②过渡(恢复)期:该期病理特征是桃拉综合征过渡期的典型特征。在HE染色的组织病理切片上,这样的病灶表现为角质层被侵蚀,暴露的表皮血细胞和上皮被大量弧菌感染和侵袭。在桃拉综合征过渡期,对虾淋巴器官的组织切片在HE染色后观察,可能外观正常。但如果应用TSV特异性的cDNA探针对这些切片进行免疫组织化学染色(ISH),就可以观察到大量的病毒聚集在淋巴小管的外周实质细胞内。
③慢性期:该期病虾的组织病理变化不明显,仅可见大量的“类淋巴器官球体”(LOS)。类淋巴器官球体可能与成对淋巴器官的主体相连,或脱离形成异位的类淋巴器官体,位于血腔的局部区域(如心、鳃或皮下结缔组织中等)。类淋巴器官球体由淋巴器官细胞和血淋巴细胞呈球形堆积而成,但从其球形特征以及缺乏中心管(典型的淋巴器官小管),可与正常淋巴器官进行区别。应用TSV特异性的cDNA探针进行免疫组织化学染色,这些“类淋巴器官球体”的部分细胞会呈现阳性反应,而其他靶组织细胞呈阴性反应。
【诊断方法】
(1)初步诊断仅急性期的病虾表现出行为的改变。急性期病虾呈现缺氧状态,常聚集在池塘边缘或水面等溶氧高的地方,从而吸引大量的海鸟捕食。因此由垂死对虾吸引来的海鸟在虾池上空大量聚集,常可代表虾池内暴发了严重的流行病(通常是桃拉综合征或白斑综合征)。通常可以依据流行病学、临床特征和病理特征对急性期桃拉综合征做出初步诊断:病虾虾体全身淡红色、尾扇和游泳足鲜红色,游泳足或尾足边缘处上皮呈灶性坏死,常死于蜕皮期间,表现为软壳、空腹等特征。
(2)样品采集采集病虾10尾,健康虾150尾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中,对虾幼体、仔虾取完整个体,幼虾和成虾取虾的头胸部,非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1~0.5g。
样品采集的要求参照SC、T7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分:压片显微镜检查法)》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(3)组织和病理学检查依据前述病虾的组织病理特征对该病作出诊断。该方法适用于桃拉综合征的急性期、过渡期和慢性期患病对虾的确诊和对桃拉综合征的筛查,不适用于对潜伏性感染或非感染性携带病毒标本进行疾病诊断。过渡期病虾角质层上皮多处出现不规则黑化斑,血细胞聚集,软壳及虾红素不明显。慢性期一般无明显临床症状。
(4)实验室诊断和病原学鉴定
①生物诊断法:采用SPF凡纳滨对虾幼虾作为桃拉综合征病毒指示器,对疑似感染虾进行生物检测,具体方法有口服法和注射法。口服法:该法比较容易操作,可用较小的SPF凡纳滨对虾幼虾进行试验。指示虾随机分为两组,其中感染组以剁碎的疑似感染虾样品饲喂,对照组以正常饲料饲喂,然后对两组虾进行临床观察和大体病理、组织病理学诊断。注射法:将采集的可疑虾头或全虾样品与TN缓冲液或2%的无菌生理盐水按1:2或1:3混合匀浆,离心取上清作为接种物,对指示虾进行肌内注射,然后进行临床观察和外观症状、组织病理学诊断。注射接种法宜采用较大的指示虾进行。
②免疫检测技术:
斑点酶免疫反应(DBI):该法以感染虾或SPF虾血淋巴制取纯化病毒,作为检测抗原,点加于MA-HA-N45反应板表面,干燥后,以磷酸盐缓冲液和含山羊血清与酪蛋白的吐温20进行阻断。用单抗TSVMAb1A1进行斑点酶免疫反应。
其他抗体检测方法:包括利用TSV MAb1A1单克隆抗体的间接荧光抗体法(IFAT)和免疫组化法(IHC)等。这些方法适用于组织印片、冰冻切片和脱蜡的固定组织样品及Davidson'sAFA固定的组织样品中的病毒检测。
③分子检测技术:目前已开发有原位杂交实验(ISH)、逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和实时定量逆转录聚合酶链反应(real-timequantitativeRT-PCR)等方法。原位杂交实验是采用非放射性的以地高辛标记的eDNA探针进行,敏感性高于传统的病理组织学诊断方法。逆转录聚合酶链反应法适用于对虾的各生活期、非对虾的生物和底泥等样品中TSV带毒情况的定性检测,以进行病原筛查和疾病的确诊,但该法单独使用时不适用于对病毒量、存在状态(玷污、携带和感染状态)或感染活性等的估测以及宿主感染程度的评估。实时定量逆转录聚合酶链反应法具快速、特异和敏感优点,对TSV基因组目标序列检测灵敏度大约为100个拷贝。
【防治方法】
(1)预防进行水体消毒,每10~15天(特别是在进水、换水后)应及时用漂白粉等含氯消毒剂消毒。调控水质,保持整虾池水质平衡及稳定。虾池pH一般维持在8.0~8.8,氨氮0.5mg/L以下,透明度维持在30~60cm。在养殖过程中,定期使用水质及底质改良剂,改良养殖池底质。特别是在养殖中后期,应用光合细菌、硝化细菌等微生态制剂的改良剂进行水质和底质改良。配合使用维生素、聚维酮碘等进行预防。也可以在饲料中添加生物活性物质或免疫促进剂,增强虾体非特异性免疫功能。
(2)控制可通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病的暴发。对苗种场、良种场应实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度;加强疫病监测与检疫,掌握其流行情况。
(3)处理TSV检疫阳性结果的亲虾和商品养殖虾必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。
3.黄头病
对虾传染性疾病。该病急性感染的对虾在染病2~4天时即出现停食等症状,死亡率高。濒死虾头胸部因肝胰腺发黄而变成黄色,因此称之为黄头病。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。
【病原体】黄头病毒(Yellow head virus,YHV)。
【流行与危害】黄头病最先(1990)在泰国东部和中部地区的养殖斑节对虾中出现,随后在印度、中国、马来西亚、印度尼西亚、菲律宾、越南等亚洲地区和美洲国家流行和蔓延。自然或人工感染状态下,可感染斑节对虾、食用对虾、日本囊对虾、墨吉对虾、凡纳滨对虾、细角对虾、白对虾、褐对虾、桃红对虾、刀额新对虾、绿尾新对虾等多个对虾品种。斑节对虾为主要受感染者,可能是黄头病毒的自然宿主。自然状态下黄头病毒还可感染日本囊对虾、墨吉对虾、白对虾,试验感染条件下感染斑节对虾、凡纳滨对虾、细角对虾、褐对虾、桃红对虾、白对虾,引起较高死亡率。该病严重影响养殖约50~70d的对虾,感染后3~5天内发病率高达100%,死亡率达80%~90%。
水平传播是该病病原的主要传播方式。鸟类也是传播媒介之一,海鸥等鸟类摄食患病对虾,然后通过排泄物将病毒传播到邻近的池塘中去。
【症状及病理变化】黄头病能引起对虾迅速大量死亡,常见患病虾摄食量先增大然后突然停止,一般2~4天内就会出现头胸部发黄和全身发白的临床症状。许多濒死虾聚集在池塘角落的水面,肝胰腺比正常虾软且发黄,与健康虾肝胰腺的褐色有明显区别。
黄头病毒主要侵染外胚层和中胚层起源的组织器官,可感染血淋巴、造血组织、鳃瓣、皮下结缔组织、肠、触角腺、生殖腺、神经束、神经节等,出现全身性细胞坏死。组织压片可观察到中度到大量球形强嗜碱性细胞质包涵体;血淋巴涂片可观察到中度到大量血细胞发生核固缩和破裂;组织切片可观察到坏死区域有球形强嗜碱性细胞质包涵体,直径为2μm或稍小,胃皮下组织和鳃是观察特征性包涵体的最佳部位。
【诊断方法】根据流行病学、临床特征和病理特征可以做出初步诊断,确诊需通过实验室检查。
(l)样品采集采集病虾10尾、健康虾150尾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中,对虾幼体、仔虾取完整个体,幼虾和成虾取虾的头胸部,非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1~0.5g。
样品采集的要求参照SC/T 7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第l部分:压片显微镜检查法》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(2)组织及病理学检查
① 组织压片的快速染色法:取濒死虾鳃丝或表皮用Meyer's HE染色,观察细胞内球形强嗜碱性细胞质包涵体。该方法适用于对虾活体中的黄头病毒检测,但不适于非感染性病毒携带样品的诊断及对宿主进行组织病理学评价。
② 组织病理学诊断:HE染色后观察各种不同组织的病理变化和强嗜碱性细胞质包涵体。本法适用于对虾感染黄头病毒初步诊断或未知疾病样品组织病理学评价,不适于非感染性病毒携带样品的检测。
③ 电镜诊断:可对病虾鳃、淋巴器官等的病毒粒子观察和确诊。
(3)病原学鉴定
① 原位杂交法:用YHV特异性的地高辛标记的cDNA探针进行,敏感性比病理组织学诊断法高,适用于黄头病毒敏感宿主的感染程度及病毒扩增状况的评估和疾病确诊。
② RT-PCR检测法:通过RT-PCR检测YHV的特定基因。适用于对虾各个生活期及其他生物或底泥等样品的黄头病毒情况进行定性检测,也适合于病原筛查和疾病确诊。
④ 免疫检测技术:通过制备的抗黄头病毒特异性抗体来检测病毒。可取活虾血淋巴,采用Western blot、ELISA或免疫荧光等方法鉴定样品是否有黄头病毒感染,从而进行确诊。
【防治方法】
(l)预防对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫,掌握流行病学情况。通过培育或引进抗病品种、切断传染源及加强饲养管理等综合措施控制本病。
(2)控制苗种繁殖场内YHV检疫阳性的亲虾和苗种应全部扑杀;病毒阳性的种用和商品养殖虾必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。
4.罗氏沼虾白尾病
又称罗氏沼虾肌肉白浊病,是一种急性病毒性疾病,主要危害罗氏沼虾苗种,以急性死亡、病虾肌肉呈白斑或白浊状为特征。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。
【病原体】罗氏沼虾野田村病毒(Macrobrachium rosenbergiinodavirus,MrNV)及其卫星病毒-超小病毒(Extra small virus,XSV)。
【流行与危害】本病最先在泰国被发现,随后出现于中国及圭亚那。目前该病已在中国、泰国、印度、越南、缅甸、澳大利亚、加勒比海地区(法属圭亚那等)等国家和地区发生并流行。浙江省近年采用无野田村病毒苗种培育技术,自2005年以来未检出病毒。
罗氏沼虾是病毒主要的易感宿主,日本沼虾、秀丽白虾、克氏原螯虾等养殖品种未发现发生罗氏沼虾野田村病毒的感染。病毒主要感染罗氏沼虾虾苗,淡化后3天至3周是疾病高发时期,严重时死亡率可高达90%以上,目前没有有效控制措施。发病后部分苗种可存活并长至商品规格的成虾,但有发病史的虾可携带病毒,造成子代虾苗的发病。成虾及亲虾可查出病毒,但未发现MrNV感染引起的大规模流行。
病毒可通过水平和垂直传播感染,其中带毒种虾垂直传播是引起我国虾苗发病的重要原因;带病毒水体、饵料、工具、未彻底消毒的育苗池等均可传播病毒;有学者报道带病毒的轮虫等生物饵料也可传播疾病。
虾苗池缺氧、水质不良及营养因素等也可引起虾体肌肉白浊,但这类白浊分布于整个腹部,无分散的白浊斑点,改用水质良好的水后虾苗的白浊可消退;病毒感染引起的白浊不能消退并可在虾群中迅速传播。
【症状及病理变化】发病虾苗先在腹部出现白色或乳白色混浊块,而后逐渐向其他部位扩展,最后除头胸部外,全身肌肉呈乳白色。虾甲壳不出现白斑,这一点可区别于对虾白斑综合征。
发病虾苗腹部肌纤维、肝胰腺、血细胞、心脏和鳃组织胞浆内可观察到嗜碱性包涵体;超微病理观察可发现肌纤维间线粒体肿胀、变形,肌质网变性、坏死和空泡化,表明细胞处于缺氧和钙代谢紊乱状态;肌细胞包涵体内存在大量晶格排列、无囊膜、大小为26纳米的球状病毒颗粒。用病毒核酸探针或抗MrNV单抗进行免疫酶染色,可发现肌肉及组织间隙细胞内存在大量病毒颗粒。
【诊断方法】
(1)初步诊断可根据虾苗腹部出现白色或乳白色混浊块、肌肉白浊、个别虾苗腹部存在分散的白浊点,排除水质因素引起的肌肉白浊后作出初步诊断。应与对虾传染性肌肉坏死病相区别。
(2)样品采集发病虾苗应采集150尾以上,正常虾500尾以上,取完整个体,用于病毒核酸提取或ELISA测定;种虾应采集病虾10尾,用于病毒测定。
(3)组织和病理学检查典型病例切片经HE染色后,可发现嗜酸性包涵体,为本病重要特征,但此方法费时,且观察难度较大,诊断意义不大。
(4)实验室诊断和病原学鉴定
①RT-PCR检测法:用MrNV特异性的引物进行RT-PCR检测,适用于对虾各种样品、环境生物和饵料生物的各种样品以及其他非生物样品中MrNV的定性检测,具有高灵敏度和高特异性,适用于病原筛查和疾病确诊。
②三抗体夹心ELISA法:其过程是先用兔抗MrNV抗体预包被酶标板,然后加入待测样品、阳性及阴性对照,通过预包被抗体捕捉待测样品中的MrNV,再加入小鼠抗MrNV单抗,洗脱后最后加入抗小鼠单抗的酶标抗体,然后进行显色,有病毒的样品可显示较深的颜色。
【防治方法】
(1)预防对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。并加强疫病监测与检疫,掌握流行病学情况。通过培育或引进抗病品种,提高抗病能力。加强饲养管理,降低发病几率。在疾病发生流行时,未发病苗种场可采用严格消毒、控制外来人员进入苗种生产车间等办法,防止疾病的传播。使用抗病毒药及微生物制剂可延缓疾病过程,减少死亡,但养成的成虾可能携带病毒。
(2)控制病毒检出阳性的苗种场应停止生产,繁殖场亲虾和苗种检疫阳性的全部扑杀,并按有关规定对发病养殖区、用具和种虾作无害化处理;检疫阳性虾禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料。
5.对虾杆状病毒病
对虾杆状病毒病是威胁对虾幼体、仔虾和幼虾阶段的疾病。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。
【病原体】对虾杆状病毒(Baculovirus penaei)。
【流行与危害】该病毒主要感染西半球的养殖及野生对虾。目前已发现3个地方株,分别分布在东南大西洋、美国、墨西哥沿岸和加勒比海、美国南、中北部太平洋沿岸及夏威夷。该病毒宿主广泛,可感染滨对虾属、美对虾属、明对虾属和沟对虾属等在内的所有对虾品种,以幼体、仔虾和早期幼虾对病毒最为敏感。病毒主要经对虾相互残食以及粪-口途径经口传播。亲虾产卵时排泄带毒粪便也可使病毒传给下一代种群。试验表明轮虫和卤虫可将该病毒传给对虾幼体。
【症状及病理变化】病虾嗜睡厌食,体色呈蓝灰色或蓝黑色,胃附近白浊化,浮头,停滞岸边,鳃和体表有固着类纤毛虫、丝状细菌、附生硅藻等生物附着,容易并发褐斑病等细菌性疾病,最终侧卧于池底死亡。解剖后可发现肝胰腺肿大、软化、发炎或萎缩硬化,肠道发炎等。
病毒主要侵害肝胰腺腺管、中肠等上皮细胞。感染病毒后可在肝胰腺和中肠上皮细胞中形成细胞核内核型多角包涵体,少量包涵体也可在粪便中游离存在。肝胰腺和中肠上皮细胞核内存在数量不等的金字塔状包涵体,包涵体为具有明显折射性的四面体,高度约20μm。受感染的对虾肝胰腺小管和前中肠的上皮细胞的细胞核肥大,核内有1个至几个角锥形包涵体。核仁被挤到一边,并退化或消失,染色质分布于核的边缘,呈环状排列。
【诊断方法】根据流行病学、临床特征和病理特征可以做出初步诊断,确诊需进行实验室诊断。诊断时应注意与斑节对虾杆状病毒病相区别。
(1)样品采集采集病虾10尾、健康虾150尾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中,对虾幼体取完整个体,仔虾取头胸部,幼虾和成虾取小块肝胰腺或小截中肠组织。粪便样品采集:将幼虾或成虾暂养于水族箱中,待数小时直至水族箱底部出现粪便,用干净的塑料虹吸管吸取排泄物,注入玻璃试管中。
样品采集的要求参照SC/T 7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒病诊断规程第1部分:压片显微镜检查法》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(2)诊断方法
① 压片显微镜检查法:取病虾肝胰腺和中肠进行湿片压片,显微镜检查发现角锥形包涵体基本可诊断。结果可疑时根据组织病理或PCR结果确认。
②组织病理学诊断法:观察组织切片经H& E染色后细胞核内角锥形包涵体。适用于对虾感染对虾杆状病毒情况的初步诊断或未知疾病样品的组织病理学评价,不适用于非感染性携带病毒的样品检测。
③透射电镜诊断法:制备病虾中肠腺超薄切片,透射电镜检查包涵体和核质中有无许多杆状病毒颗粒,从而确诊。
④原位杂交法:采用地高辛标记eDNA探针进行病毒检测,敏感性高于病理组织诊断法,适用于对虾杆状病毒敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估和疾病的确诊。
⑤PCR检测法:通过聚合酶链式反应,检测病毒特定基因。适用于大量样品的病毒筛查和疾病确诊,可检测对虾活体、粪便、冰冻和冰鲜虾产品的对虾杆状病毒的筛查和疾病诊断,但单独使用不能对病毒剂量、感染活性及宿主感染程度作出评估。
【防治方法】
(1)预防对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫,掌握流行病学情况。通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病。加强亲虾及幼体的检疫,及时销毁受病毒污染的对虾,染疫场的池塘、用具彻底消毒。改善水质和采取合理的养殖密度,可降低本病的发生。
(2)控制繁殖场亲虾和苗种检疫阳性的全部捕杀;种用和商品养殖虾检疫阳性的必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作饵料使用。
6.传染性皮下和造血器官坏死病
对虾的一种传染性疾病,主要感染细角对虾和凡纳滨对虾。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为二类动物疫病。OIE将其列为必须申报的疾病。
【病原体】传染性皮下和造血组织坏死病毒 (infctioushypodernmm and haematopoietic necrosis virus,IHHNV),又名“细角对虾浓核病毒”(Penaeus stylirostris densovirus,PstDNV)。
【流行与危害】IHHNV可感染世界各地的养殖对虾,主要感染太平洋东部沿岸野生对虾、太平洋岛屿(包括夏威夷群岛、法属波利尼西亚、关岛和新卡里多尼亚)的养殖对虾。近年来在东南亚和中东地区的养殖和野生对虾中存在该病的流行,该病在我国也有较高的发病率。细角对虾、凡纳滨对虾、斑节对虾等大部分对虾品种都可被感染,细角对虾死亡率可达90%以上,稚虾受危害最为严重。该病毒主要通过带毒虾及其他甲壳类受病毒污染水体传播,虾类同类残食或海鸟也可传播病毒。发病后存活的对虾仍带毒,可以通过垂直传播方式传播该病。
【症状及病理变化】细角对虾的稚虾患急性传染性皮下和造血组织坏死病后,摄食量明显减少,继而出现行为及外观异常。患病对虾可缓缓上升到水面,静止不动,然后翻转后腹部向上并缓慢沉到水底,这种行为可反复进行并持续数小时,直到无力继续下去或被其他虾吞食。此感染期的细角对虾表皮上皮层(尤其是腹部背板接合处)常出现白色或浅黄色斑点,使整个虾体呈现斑驳的外观。在濒死的细角对虾中,这些斑点会有所褪色,导致虾体色偏蓝。在感染的末期,细角对虾和斑节对虾濒死时体色明显变蓝,腹部肌肉不透明。
在凡纳滨对虾中,由IHHNV引起的“传染性皮下和造血组织坏死病”存在一种慢性表现形式,即“矮小残缺综合征(runt-deformity syndrome,RDS)”。RDS病虾生长缓慢、体型畸形,患病稚虾还出现额角弯曲、变形、触角鞭毛皱起、表皮粗糙或残缺。患RDS的凡纳滨对虾稚虾群体中,体长普遍偏小,且个体之间体长差异很大。可用体长变异系数(coefficient of variation,CV)来评估凡纳滨对虾和细角对虾稚虾群体是否患有RDS:RDS群体的CV值多大于30%,甚至达到90%;而未患病群体的。CV值通常为10%~30%。
在组织病理学方面,IHHNV主要感染起源于外胚层和中胚层的组织细胞,主要有表皮、前肠和后肠上皮、性腺、淋巴器官和结缔组织细胞,基本不感染肝胰腺细胞。靶组织细胞核内可观察到嗜酸性包涵体,即典型的考德里A型(Cowdry type A)包涵体。
【诊断方法】在本病严重暴发流行时,可根发病史、临床特征及病理特征做出初步诊断,确诊需要通过实验室检查。
(1)样品采集采集病虾10尾、健康虾150尾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中,对虾幼体、仔虾取完整个体,幼虾和成虾取头胸部,非对虾的甲壳类动物参照对虾的方法取样。非生物样品取0.1~0.5g。
样品采集的要求参照SC/T 7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分:压片显微镜检查法》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(2)组织及病理学检查
① 组织病理诊断法:组织切片经HE染色后,观察细胞核内是否存在Cowdry A型包涵体,从而进行诊断。该方法适用于有症状对虾的初步诊断或未知样品的组织病理学评价,不适用于无症状带病毒标本的病毒检测。
② 电镜诊断:通过超薄切片,观察靶组织细胞核内有无IHHNV病毒粒子进行确诊。
(3)病原学鉴定
① 分子杂交技术:采用地高辛标记的IHHNV eDNA探针进行病毒检测,灵敏度高于病理组织诊断法。适用于成虾、幼虾、仔虾、幼体和受精卵活体、冰鲜或冰冻产品和其他甲壳类动物的病毒筛查、有临床病症病虾的确诊。
② PCR检测法:通过聚合酶链式反应检测IHHNV特定基因。适用于各种对虾样品、环境生物和饵料生物样品以及其他各种非生物样品的IHHNV带毒的高灵敏度定性检测。
【防治方法】
(1)预防对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫,掌握流行病学情况。通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病。有效的预防措施主要是加强对虾、特别是进口对虾的检疫,并销毁染疫对虾,对发病虾场及其设施要进行彻底消毒。用SPF亲虾进行繁育。
(2)控制繁殖场亲虾和苗种检疫阳性的全部扑杀;种用和商品养殖虾检疫阳性的必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。
7.斑节对虾杆状病毒病(MBVD)
一种对虾病毒性传染病,严重威胁对虾幼体、仔虾和幼虾的健康。2008年《中华人民共和国农业部公告》第1125号将其列为三类动物疫病。
【病原体】斑节对虾杆状病毒(Penaeus monodon-type baeulovirus,MBV)。
【流行与危害】斑节对虾杆状病毒病在东亚、东南亚、印度次大陆、中东、澳大利亚、印度尼西亚、东非、马达加斯加养殖和野生虾中广泛分布,随着斑节对虾的引进,病毒也传人地中海、西非、塔希提岛和夏威夷,还有南、北美洲和加勒比海的一些养殖地区。
斑节对虾杆状病毒可感染对虾属、明对虾属、囊对虾属和沟对虾属的多种对虾。除了卵和无节幼体阶段都可被该病毒感染。野生虾带毒率较低,病毒分布地区流行和感染都比较严重,幼虾和成虾携带病毒高达50%~100%。是宿主虾的幼体、仔虾和早期幼虾的潜在严重病原。
相互残食和粪一口途径的经口传播为该病的主要的传播方式。亲虾产卵时排泄被病毒污染的粪便,而使病毒传给下一代种群。
【症状及病理变化】受感染后的幼体除体色加深外,并无特别的症状,多数携带病毒的虾活动正常。幼体群常无明显症状出现而大量死亡。死亡率与养殖环境有关,一般在20% ~90%。感染严重的病虾往往活力降低、食欲下降、体色较深,鳃和体表有固着类纤毛虫、丝状细菌、附生硅藻等生物附着。
MBV侵害的对虾组织是肝胰腺腺管和中肠的上皮细胞,显微镜下可观察到受感染的对虾肝胰腺或中肠的上皮细胞核肿大,核内有单个或多个折射率高的球形包涵体,单个包涵体直径约为0.1~2.0μm。受感染的对虾粪便压片可观察到带折光性的近似球形的包涵体,大小约20μm,在新鲜粪便中,病毒包涵体常成团聚集,并被核膜包裹着。组织病理观察感染MBV的对虾肝胰腺细胞的细胞核明显肥大,内有单个或多个近球形的核型多角体型包涵体,使染色质减少并向边缘迁移。在中肠上皮细胞中也偶尔可看到类似的现象,包涵体呈亮红色。肝胰腺细胞受感染的比率越大,说明病毒感染程度越重。
【诊断方法】
(1)初步诊断根据流行病学、临床特征和病理特征可作出初步诊断,确诊需进行实验室诊断。诊断时应注意与对虾杆状病毒病相区别。
(2)样品采集采集病虾10尾、健康虾150尾,按不同的大小或感染期取不同组织样品。其中,对虾幼体取完整个体,仔虾取头胸部,幼虾和成虾取小块肝胰腺或小截中肠组织。粪便样品采集:将幼虾或成虾暂养于水族箱中,待数小时直至水族箱底部出现粪便,用干净的塑料虹吸管吸取排泄物,注入玻璃试管中。
样品采集的要求按SC/T 7202.1-2007《斑节对虾杆状病毒诊断规程第1部分:压片显微镜检查法》附录B的规定或者按照OIE《水生动物疾病诊断手册》中的列表要求采样。
(3)组织和病理学检查
①压片显微镜检查法:通过光学显微镜观察新鲜组织样品或粪便中近球形的MBV核型多角体形成的情况进行初步判断。适用于对虾活体及其粪便中的MBV非致死性的疾病筛查和诊断,不适于对病毒的非感染性携带的标本进行诊断以及对宿主进行组织病理学评价。
②组织病理学诊断法:观察经HE染色后细胞核内单个或多个近球形的核型多角体形成的情况进行判断。适用于对虾感染情况的确诊或未知疾病样品的组织病理学评价。不适于对病毒的非感染性携带的标本进行病毒检测。
(4)病原学鉴定
①原位杂交法:采用非放射性的以地高辛标记的cDNA探针进行,敏感性高于传统的病理组织学诊断法。适用于进行MBV敏感宿主组织细胞的感染程度及病毒扩增状况的评估和疾病的确诊。
②PCR检测法:通过聚合酶链式反应,检测特定基因。适用于进行病原筛查和疾病的确诊。其中核型多角体基因保守序列法仅适用于对虾,包括对虾活体、粪便以及冰冻和冰鲜虾产品的病毒筛查和疾病的初步诊断。单独使用时不适于对病毒量或感染活性的估测以及宿主感染程度的评估。
【防治方法】
(1)预防对苗种场、良种场实施防疫条件审核、苗种生产许可管理制度。加强疫病监测与检疫,掌握流行病学情况。通过培育或引进抗病品种、切断传染源以及加强饲养管理等综合措施控制本病。加强亲虾及幼体的检疫,销毁染疫对虾。为避免亲虾的粪便、受污染卵将病毒传给下一代,在孵化场可采用福尔马林、碘伏和干净的海水彻底清洗无节幼体和卵,孵化场应相对独立,具有良好的隔离设施,防止病毒在孵化场内的传播。
(2)控制繁殖场亲虾和苗种检疫阳性的全部扑杀;种用和商品养殖虾检疫阳性的必须进行无害化处理,禁止用于繁殖育苗、放流或直接作为水产饵料使用。
8.肝胰脏细小病毒状病毒病
【病原体】肝胰腺细小病毒状病毒(Hepatopancreatic parvovirus,HPV)。
【流行与危害】首先发现在新加坡和马来西亚养殖的墨吉对虾内,以后又发现在野生的和养殖的中国明对虾、波斯湾的短沟对虾、菲律宾的斑节对虾和澳大利亚的食用对虾。在流行病发生后4~8周内,墨吉对虾的累积死亡率为50%,短沟对虾的死亡率则高达100%,并常发生弧菌病的继发性感染。在中国明对虾上的致病性尚不十分明显。受感染的种群在人为的拥挤条件下会加重病情。
【症状及病理变化】病虾无特有症状,只是食欲不振,行动不活泼,生长缓慢,体表附着物多,偶然发现尾部肌肉变白。幼虾出现这些症状后很快就死亡,有时有继发性细菌或真菌感染。
主要的病理变化是肝胰腺坏死和萎缩。肝胰管上皮细胞的细胞核过度肥大。核内有一个大而显著的包涵体。这种包涵体为嗜碱性,PAS阴性,弗尔根阳性,近于圆形或椭圆形,在光学显微镜下就可看到。在中国明对虾仔虾的前中肠上皮细胞肥大的核中,也发现有正在发育的嗜伊红的包涵体,但较为少见,没有发现充分发育的嗜碱性包涵体。正在发育的包涵体,是由电子密度很细微的颗粒物质(即病毒基因基质)和病毒粒子组成。
【诊断方法】初步诊断可取病虾的肝胰腺,用FAA液或包氏液固定,HE染色,检查出明显的嗜伊红,弗尔根染色阳性的核内包涵体,核仁被挤到一边,染色质分布在核的周边。确诊须用透射电镜观察核内包涵体中的病毒粒子。
【防治方法】
(1)严格检疫,杜绝病原从亲虾或苗种带入。
(2)使用无病毒污染或经过过滤、消毒的海水。
(3)养殖虾池应彻底清淤消毒。
(4)投放健壮苗种或经消毒处理的虾苗。
(5)大池改小池,浅水改深水,合理密养,设立增氧机。
(6)投喂优质配合饲料,或添加免疫多糖类和提高抗病力的中草药。
(7)稳定虾池理化因子和藻相,投放环境保护剂和有益细菌或活性生物制剂。
(8)早晚巡池,发现异常不乱用药或滥用药,应取样检查,要在准确诊断的基础上对症或对因用药,防止细菌继发感染等,实施全面健康的养殖管理。
9.日本对虾中肠腺坏死杆状病毒病
【病原体】中肠腺坏死杆状病毒(Baculoviral midgut gland necrosis type viruses,BMNV)。一种C型杆状病毒,病毒粒子大小为72纳米×310纳米,具双层被膜。
【流行与危害】中肠腺坏死杆状病毒病只侵害日本囊对虾。在日本南部的孵化场中,每年5-9月常发生中肠腺坏死杆状病毒病造成大批死亡。生病的仔虾主要为P2-P12。生病时的水温为19~29.5℃,pH为7.8~8.8。不患此病的仔虾死亡率一般为30%以下,患此病者死亡率一般为70%~100%。在巴西和夏威夷养殖的日本囊对虾也发生此病。
【症状及病理变化】中肠腺坏死杆状病毒病病毒主要侵害日本囊对虾的仔虾。仔虾的肝胰腺“白浊”,即混浊不透明变白色,这是最容易看到的症状。随着病情的发展,白浊的程度越来越明显。严重受害的仔虾(长度为6~9mm)从症状上很容易区别。病虾缺乏活力,漂浮在水面。发作突然,死亡率高。
【诊断方法】初步诊断可根据病虾的外观症状,以及日本囊对虾的糠虾幼体特别是仔虾的突然发病和死亡率很高的情况。确诊可用病虾肝胰腺切片或压片,HE染色后,在光学显微镜下看到肥大的细胞核而没有包涵体,或用电子显微镜观察超薄切片,看到病毒粒子。荧光抗体诊断技术,可以快速诊断,并可发现症状不明显的带病毒者。
【防治方法】
(1)引进日本囊对虾时应严格检疫,不从BMNV的发病地区引进对虾。
(2)受精卵用聚维酮碘溶液进行药浴5~10分钟。
(3)孵化设施及用水要消毒处理。
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