基因改良的养殖罗非鱼在现代集约化养殖系统中饲养时容易感染猪链球菌。GIFT是在中国南方广泛养殖的具有重要商业价值的鱼类。

实际上， GIFT 对猎鼻链球菌感染的调节反应中的作用被低估了，头肾在硬骨鱼类中具有重要的免疫功能。主要目的是确定miRNA.在感染的 Gft 链球菌头肾中的可能功能。

对从 GIFT 头肾组织中提取的两个文库进行高通量深度测序，产生了 12，089，630和 12，624，975的干净读数。生物信息学分析分别在CO和IN文库中鉴定了1736和1729个保守的miRNA以及164和165个新型miRNA。

发现三种miRNA上调，四种miRNA在感染链球菌感染的GIFT中下调。通过实时荧光定量PCR验证了这些miRNA的表达。RNAhybrid和TargetScan用于识别互补的miRNA和mRNA靶位点，基因本体和京都基因和基因组百科全书数据库用于注释和预测生物途径的潜在下游调控。

猪非鱼的爆发阻碍了中国罗非鱼产业的发展。了解感染的 Gift 链球菌感染 GIFT 的 miRNA 转录组对于探索 miRNA 调控的免疫应答以及研究新型调控网络以预防和治疗未来猪鼻链球菌感染具有重要意义。

基因改良养殖罗非鱼是中国南方具有重要商业价值的养殖鱼类。粮食及农业组织的数据显示，约446个养殖国的罗非鱼产量达到8万吨。

由于其种内交叉和相对快速的生长速度，在集约化培养系统中饲养时，GIFT极易感染由猪链球菌和无乳链球菌引发的细菌性疾病。更好地了解GIFT对感染的调节反应将为免疫调节和GIFT育种提供关键信息。

鱼类的非特异性免疫系统在感染的各个阶段都起着重要作用。因此，了解免疫调节机制可能有助于更好地预防疾病。MicroRNA是小的非编码单链RNA，存在于植物，动物和一些病毒中。

MiRNA通过与其靶mRNA的3'-非翻译区域结合，在RNA沉默和基因表达的转录后调控中发挥作用。MiRNA介导的调控在先天免疫应答、炎症性疾病、细胞信号转导和靶向治疗中;miRNA的功能主要在哺乳动物和植物中得到研究。

包含 645 个物种的 22335 个 miRNA，表达 8288 个成熟 miRNA。许多成熟的miRNA在脊椎动物分类群中高度保守，但它们在鱼类宿主免疫反应中的作用仅在少数物种中已知。

主要是斑马鱼，大型黄花鱼和草鱼，已经鉴定并分类了几种调节鱼类先天性和适应性免疫反应的免疫特异性miRNA，包括miR-192，miR-194，miR-146a，miR-155a / b和miR-122。

哈维弧菌感染斑马鱼的miR-194和miR-146a显著降低，脂多糖感染斑马鱼的miR-155a/b和miR-4下调Toll样受体4和下游核因子kB活性。在接受聚核糖苷酸处理的感染大黄鱼中检测到miR-3-214p、miR-3-181p和miR-10c的上调表达。

let-118i和miR-4下调TLR3和核因子白细胞介素6-3，以应对感染嗜水气单胞菌的草鱼的过度炎症反应。其中一些miRNA的异常调节会破坏细胞内信号网络和炎症反应，从而导致病理状况。

近年来，使用各种分子生物学技术在罗非鱼中检测和鉴定了越来越多的免疫学相关基因。随着尼罗罗河基因计划的成功完成，miRNA介导的基因在免疫反应中的表达和调控机制的研究将变得越来越重要。

尼罗鱼miRNA转录组数据尚未报道，并且直到现在还没有研究GIFT免疫应答中miRNA表达谱的变化。目的是鉴定和分析参与GIFT对猪鼻链球菌感染免疫反应的miRNA及其靶基因。

通过高通量测序对来自感染猪链球菌的GIFT的两个小RNA文库和未感染的GIFT进行测序。鉴定了MiRNA，并使用RNA杂交和TargetScan预测miRNA靶基因，并使用基因本体和京都基因和基因组百科全书数据库探索下游靶基因的潜在生物加工。

鉴定了参与免疫应答的miRNA及其靶基因，并通过定量实时PCR验证了miRNA的表达谱。鉴定参与免疫调节的miRNA是更好地了解其在细胞内信号网络和炎症反应中的功能的必要先决条件。

由猪链球菌引起的链球菌病无疑是罗非鱼的主要细菌性疾病之一。据报道，它在中国四个以上省份的罗非鱼养殖区造成巨大死亡和经济损失。很少有研究描述罗非鱼中miRNA介导的免疫反应调节的分子机制。

实验前确定96小时半致死性猪链球菌剂量在礼物是 107氟氯化钾-1。GIFT感染浓度为107氟氯化钾-1可刺激自身免疫系统应对细菌入侵后24小时感染伊尼奥链球菌，存活率为90%。

在之前的一项研究中，发现感染链球菌感染的GIFT头部肾组织中C型溶菌酶、热休克蛋白70、白细胞介素-1β、干扰素-γ和肿瘤坏死因子-α在感染后96 h达到峰值。

延长感染时间削弱了鱼自身的免疫反应，在感染后2 h和36 h注射487氟氯化钾-1.在GIFT感染24小时LD96小时后出现以下症状50、病鱼开始在水中间歇性旋转，游泳动作不平衡，眼白角膜混浊，脾脏肿大发红，肝充血，肾脏出血，胆囊肿大，胆汁呈深绿色。

肾脏出血可能是由于淋巴细胞减少和大量红细胞替代，以及巨噬细胞浸润率高。巨噬细胞可以通过吞噬作用减少细菌入侵。在细菌感染的早期阶段，头肾被发现是成年鱼中重要的免疫调节组织，并且被认为在哺乳动物中起着与骨髓相似的作用。

头肾主要由粒细胞、巨噬细胞以及存在任何获得性特异性或非特异性免疫调节的T和B淋巴细胞组成。在这项研究中，鉴定参与抗病原体感染和miRNA介导的调控途径的miRNA，以更好地了解由猪粒链球菌挑战引发的罗非鱼头肾的免疫调节反应。

建立来自感染猪鼻链球菌的GIFT头肾和未感染的GIFT的两个小RNA文库并对其进行测序。分别从 CO 和 IN 库共获得了 2412423和 33812845 个原始读取。

删除包含适配器序列和低质量读取的读取后，CO 和 IN 库中分别保留了 112089 和 63012624个干净读取。发现975.38%和63.39%的读数在检索数据库中没有匹配，这些未注释的序列被认为是唯一的读取。

总清洁读数包含16.72%和08.64%的保守miRNA，唯一读数包含36.13%和94.11%的保守miRNA。

发现264661和312600的独特读段以及164和165个候选新型miRNA可以映射到尼罗罗非鱼基因组序列。两个库中读取序列的长度范围从10 nt到44 nt，其中22 nt，21 nt和23 nt长读取最丰富。

已使用库中的读段数来估计测序样本中读段的丰度。CO文库中丰度最高的十种miRNA是miR-6585-5p，miR-181a，miR-181a-5p，miR-462，miR-92a-3p，miR-26-5p，miR-26a-5p，miR-10b-5p，miR-10b和miR-26a，它们占映射到miRBase序列的读段的35.4%。

这些miRNA中有6585个是IN文库中十个最丰富的miRNA，占映射到miRBase序列的读段的2.181%。在这些miRNA中，miR-92a、miR-3a-26p、miR-5a-10p、miR-26b和miR-20a在人类免疫调节信号传导和炎症反应中起重要作用。

选择并分析了19个差异表达的miRNA，在CO和IN文库之间有超过10个读数。在19个miRNA中，92个显著上调，92个与CO文库相比显著下调.，使用RNA杂交和TargetScan与尼罗罗罗鱼基因组序列筛选假定的miRNA靶基因。

用GO项注释候选靶基因，并将4个生物过程分配给预测靶标热图表明，这些差异表达的miRNA可能在免疫调节、信号传递和细胞过程中发挥重要作用。

为了验证从转录组测序数据估计的表达水平，通过qRT-PCR测量了八种miRNA的表达水平。选择八种miRNA是因为它们在感染后具有相对较高的倍数变化。

PCR结果显示，与CO组相比，IN组的miR-310-3p、miR-92和miR-127显著上调，miR-92d-3p、miR-375-5p、miR-146-3p和miR-694显著下调，与从转录组数据中获得的结果一致。这与从转录组数据中获得的结果相矛盾。

先前的观察表明，miR-146，miR-127，miR-92a，miR-310，miR-375和miR-694在鱼类和哺乳动物中起着重要的免疫调节功能。Zhang等人最近的一项研究发现。

miR-26a在暴露于脾弧菌和脂多糖的海参中上调，其靶基因被预测为E92泛素蛋白连接酶，可能通过调节参与转化生长因子-β和骨形态发生蛋白的信号通路来充当肿瘤抑制因子，在乳腺癌患者中，肿瘤组织和血清中发现miR-27a水平下调。

转基因克隆羊中miR-28失调介导了逆转录转座子样基因127的表达，Rtl1是可能导致发育迟缓的关键胎盘发育基因。MiR-694在Lass II基因敲除小鼠的肝脏中被下调，可能与肝脏失调与代谢功能障碍之间的关联有关。

发现MiR-375过表达可抑制肺表面活性物质的分泌，可能通过影响患者的肌动蛋白动力学和损伤胰腺。作为肿瘤抑制因子或癌基因，miR-310/13簇可能调节癌症中进化保守的免疫信号网络。

参与免疫相关反应的七个基因被预测为七个miRNA的靶标。补体C3和胞苷脱氨酶分别被预测为miR-92d-3p和miR-127的潜在靶标。据报道，补体C3 mRNA水平在实验性感染引发的大型黄花鱼和Miiuy黄花鱼。

补体C3的上调与先天免疫有关，先天免疫在应激后介导组织损伤中起重要作用。发现IN库中补体C3的水平明显上调，表明其作为抗炎反应防御入侵病原体的潜在调节剂的作用。

胞苷脱氨酶是一种诱变激活诱导的DNA/RNA编辑酶，与人类肿瘤发生有关。在幽门螺杆菌感染的胃上皮细胞中发现胞苷脱氨酶水平异常，有人认为这可能是亚显微镜缺失和体细胞突变积累的机制。

水生动物中的胞苷脱氨酶水平研究很少。结果表明，胞苷脱氨酶mRNA在感染24 h后下调表达可能与传染病和免疫介导的疾病有关。

Mapk信号通路的调节可能调节细胞周期基因的转录，这已被证明对于介导许多细胞过程至关重要，包括炎症反应、细胞应激、细胞分化和细胞增殖。TNF-α是癌细胞中主要的促炎细胞因子。

代谢性谷氨酸受体因其在突触信号传导中的作用而广为人知。异常谷氨酸信号传导已被证明参与人类癌症的转化和维持，包括神经胶质瘤、黑色素瘤皮肤癌、乳腺癌和前列腺癌。

结论

健康成年雄性GIFT取自中国水产科学研究院淡水渔业研究中心宜兴罗非鱼养殖场。鱼的平均重量为350±19克。在室内混凝土水箱中养殖鱼，并在处理前适应2周。在驯化过程中，水温保持在28±0.3°C，鱼保持在自然光周期和连续通气下。

并使用相对定量管理器软件进行比较。使用未配对的学生T检验来分析qRT-PCR表达结果。

(文|小虎史谈)

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参考文献

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