食源性致病菌活的不可培养状态诱导、复苏及检测的研究进展

发表时间:2024/04/08 22:51:31  浏览次数:1809  
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细菌活的不可培养(VBNC)状态,通常是指细菌在不利于自身生存环境条件下失去可培养性的一种休眠状态。这种状态下的细菌仍具有致病性或潜在致病性,并在适宜的条件下可以复苏,因此对食品和环境存在潜在的威胁。

上海理工大学材料与化学学院的赵青,上海海关动植物与食品检验检疫技术中心杨捷琳*和上海理工大学董庆利*等人总结了细菌VBNC状态的定义发展、形态特征、生理生化性质、毒力因子等,再将近年来VBNC状态诱导因素和复苏条件进行梳理归纳,最后着重介绍了检测VBNC状态的分子生物学、流式细胞仪、光学检测方法,并比较分析了3 种方法的优劣,为防控食源性致病菌的潜在危害提供参考。

1 VBNC状态的定义及特征

1.1 VBNC状态的定义

VBNC状态是指细菌在受到不利于自身生长环境下导致的一种休眠状态,常规培养条件下细菌不能增殖,但是仍具有代谢活性,给予适宜条件时细菌可复苏。通常,保持在VBNC状态的细菌保留了毒力基因和致病基因,复苏后会产生致病性和感染性。如图1所示,VBNC状态细菌菌体中细胞质密度、蛋白质、核糖体、DNA的改变会引起菌体收缩变小,细胞壁和细胞膜也会分离。

1.2 VBNC状态的特征

关于VBNC细胞的特征研究有很多,以下从细胞形态、细胞组织结构、蛋白质大分子方面分别阐述。

1.2.1 细胞形态

从细胞形态看,VBNC状态细胞与指数中期和坏死状态的细胞间存在明显差异。Wei Caijiao等用扫描电子显微镜观察不同状态的细菌细胞发现,处于指数中期的细胞呈典型的棒状,表面光滑、大小正常、分布均匀;死亡的大肠杆菌O157:H7细胞表面相对粗糙、聚集,甚至部分细胞表面出现损伤;而在VBNC状态下,细胞由典型的棒状变为短棒状,细胞体积减小,细胞相对粗糙、萎缩,形状不规则,部分细胞趋于成簇。

1.2.2 组织结构

Bai Hong等从细胞组织结构方面开展典型特征研究,用透射电子显微镜观察未诱导和诱导第20天的VBNC细胞,发现两者有着同样明显的形态学变化。基于微观分子层面,许多未诱导的细胞处于分裂期,细胞壁完整光滑,细胞膜紧密贴合。细胞质和细胞核物质被新生的细胞壁均匀地分离,核糖体均匀分布于整个细胞质基质中,位于细胞中心的类核具有致密、浓缩的结构。与未诱导的细胞相比,VBNC细胞质中电子密度增加,部分细胞出现细胞膜与细胞壁之间的间隙,导致细胞壁有一定程度的变形,使VBNC细胞形态不规则,这可能是细胞质浓缩所致。

1.2.3 蛋白质大分子

Kan Yumin等采用同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ)技术比较了西瓜噬酸菌VBNC细胞、复苏细胞和对数期细胞的蛋白图谱,在VBNC细胞和对数期细胞的对比中有60 个蛋白差异表达,在VBNC细胞和复苏细胞的对比中有469 个蛋白差异表达。研究表明在VBNC状态下,细菌细胞的培养能力、蛋白质合成和DNA复制能力降低,其中参与DNA复制和重组、糖类运输和代谢的蛋白均下调,与鞭毛运动、致病性和营养吸收相关的蛋白均上调;同时,该研究也证实了处于VBNC状态的细菌在复苏后表达致病蛋白,对人类健康安全构成威胁。

2 细菌进入VBNC状态的因素及复苏条件

2.1 VBNC状态细菌形成

1982年,Xu Huaishu等首次在海洋和河口水中分离获得VBNC细胞并对其状态进行了描述,之后在自来水、海底沉积物或土壤中都检测到了VBNC状态细胞存在。此外,在一些食品中也发现了VBNC状态细菌的存在。这是因为在食品加工及贮藏过程中存在着许多能够导致食品中所含致病菌被迫进入VBNC状态的环境因素,主要包括低温、高温、高渗透压、低氧浓度、极端pH值、寡营养等。换言之,在外界环境中能使细菌偏离最佳生长条件的胁迫因素均可能使细菌进入VBNC状态。

图2为VBNC细菌的形成机制示意图,主要涉及4 条通路,包括毒素-抗毒素(TA)系统、严紧反应、一般应激反应和细胞膜作用。1)在TA系统中,对细菌VBNC状态起调控作用的毒素基因(mazF、relE、higB、hipB、vapC、parE2)干扰翻译,抑制细菌生长,使细菌进入VBNC状态。TA系统又受严紧反应调节,因为外切聚磷酸激酶(PPK)和鸟苷五磷酸磷酸水解酶(GPPA)具有鸟苷四磷酸[(p)ppGpp]磷酸水解酶活性,导致降解多聚磷酸盐(PolyP)积聚,从而激活蛋白酶Lon/ClpP并降解抗毒素,促进细菌进入VBNC状态(图2A)。2)在严紧反应中,由于氨基酸饥饿而激活RelA蛋白,(p)ppGpp又受RelA催化合成,进而影响DNA、RNA和蛋白质的合成,导致生长停滞(图2B)。3)一般应激反应系统Sigma因子RpoS和转录调控因子OxyR作为调节应激反应的主要信号因子对VBNC细菌的形成和作用具有重要的激活作用,RpoS也受严紧反应和ClpX蛋白酶的调控,clpX基因突变导致RpoS降解减少,最终延迟细胞进入VBNC状态(图2C)。4)细胞膜上的毒素转录激活因子ToxR的降解也会导致细菌进入VBNC状态,其功能可能是对环境信号的响应(图2D)。

2.2 VBNC状态细菌复苏

处于VBNC状态的细菌具有一定的可复苏的“复苏窗口期”,一旦过了这个窗口期,复苏难度较大,并且窗口期在不同菌株之间差异很大。亚致死状态是由于化学或物理过程而受到细胞结构的损伤,但没有被杀死,并且有能力在适当的条件下修复它们的损伤时,它们就处于亚致死状态。亚致死细胞是休眠的初始阶段,随后是VBNC状态。此外,同样的复苏方法对不同种类的细菌有不同的复苏效果,甚至同一细菌不同菌株的复苏效果也不一样。

复苏VBNC状态下的细胞一般为消除压力因素或添加营养物质,但复苏的分子机制并不是一个简单的逆转过程,图3为VBNC状态细胞复苏机制示意图。在靶向自诱导信号分子(AI-2)缺失的情况下,其受体由周质结合蛋白LuxP和酶传感器LuxQ结合LuxPQ作为激酶催化组氨酸磷酸化,磷酸盐随后转移到酶蛋白LuxU和转录调节因子LuxO。LuxU和转录调节因子σ54结合促进了sRNAs的转录,sRNAs与伴侣Hfq一起破坏了转录因子LuxR的编码。LuxR是RpoS的正调控因子,LuxR被破坏后,RpoS活性降低,过氧化氢酶KatG的产生也会随之减少,进而导致细胞对过氧化氢的敏感性和不可培养性(图3A)。当AI-2浓度较高时,LuxPQ结合AI-2,并作为磷酸酶剥夺LuxO和LuxU的磷酸基,低活性LuxO导致LuxR失去抑制后,RpoS活性的增加导致KatG产量的增加,抗氧化活性的增加使VBNC细胞再次可培养(图3B)。Rpf蛋白结合VBNC细胞表面的Rpf受体,触发复苏(图3C)。Rpf和Rif组成的复合物作用于细胞壁。Rpf和Rip分别分裂糖苷键和肽键,细胞壁被重塑,进而刺激VBNC细胞的复苏(图3D)。Rpf和Rif复合体作用于VBNC细胞的细胞壁,并将其裂解产生肽聚糖片段。肽聚糖片段与PknB受体(一种跨膜蛋白)结合并触发复苏(图3E)。VBNC细胞在去除氧化、冷、饥饿、渗透应激和离子应激等应激后可以复苏(图3F)。VBNC细胞宿主可提供营养或刺激因子促进复苏(图3G)。

为了解食源性致病菌VBNC状态及其复苏后对人类的威胁,已对食源性致病菌VBNC状态的影响因素和复苏条件开展了相关研究(表1)。典型研究包括通过物理方法诱导致病菌进入VBNC状态,包括紫外线、高温、低水分、高压二氧化碳,而复苏后致病菌可恢复其培养性和代谢活性,证实了毒力基因在VBNC状态和复苏的细胞中均为高表达,但随着蛋白质聚集和活性氧水平的增加,细胞会逐渐失去复苏的能力;此外,在营养耗尽的培养基中也可诱导细菌进入VBNC状态,并且细菌存活时长可达2 个月。由此可以得出,细菌在不利于自身生长繁殖的物理或化学条件下,均可进入VBNC状态,而不同的食源性致病菌进入VBNC状态的时间、条件也不相同,这可能与致病菌本身的生存环境、生存温度、营养需求、耐酸碱度有关。

3 VBNC细菌检测方法

由于VBNC状态细菌使用常规培养方法无法增殖,因此无法被检测到,容易对食品安全和公共卫生形成潜在威胁。因此建立针对VBNC状态的食源性致病菌有效且快速检测的方法较为迫切。

3.1 分子生物学检测法

分子生物学检测法一般采用实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测细胞总数,叠氮溴化丙锭(PMA)能够进入细胞壁和细胞膜已破损的细胞,但由于VBNC状态下的细菌细胞膜是完整的,因此PMA只能对死细胞进行染色,一般将其与PCR结合测VBNC细胞数,或将qPCR与活/死细胞染色法结合得出总细胞数、活细胞和死细胞数,通过总细胞数和活细胞数差值来确定VBNC细胞数。

分子生物学检测法以准确、灵敏度高、特异性强并且能够极大提高检测速度等优势在VBNC状态细菌的检测和分析中得到了广泛的应用。但是,分子检测法也有一定的劣势,比如其程序复杂,需要技术精通的研究人员操作,同时检测仪器也十分昂贵 。

3.2 流式细胞术

流式细胞术可以快速测量、存贮、显示悬浮在液体中的分散细胞并进行自动分析和分选,该技术可以用于分析和检测那些不能用常规方法培养而得到的细胞特征参数。Live/Dead BacLight试剂盒是目前应用较多的判定活菌的方法,采用流式细胞术可以区分出只被SYTO9染色的细菌,从而得到活菌的含量,而检测到细胞处于活细胞区但平板富集后不可培养的细胞被归类为VBNC细胞。

Power等研究证明,高通量成像流式细胞术(IFC)具有高通量数据收集和图像捕获能力,可对细胞进行可视化处理并提供详细的形态分析,因此可以对VBNC细胞进行高分辨率分类,为详细了解细菌表型变化及其生理影响提供了一个平台,可以准确监测和量化,从而更好地理解表型异质性在动态微生物组中的作用。 具备筛选功能的流式细胞仪可以根据预先设置的参数范围把指定的细胞亚群分选出来,但多数流式细胞计是一种细节分辨率为零的仪器,它只能测量一个细胞的诸如总核酸量、总蛋白量等指标,而不能鉴别和测量出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。

3.3 光学检测法

荧光显微镜法是研究VBNC状态菌最基本的检测方法,也称经典方法。该方法是以吖啶橙染色荧光显微镜直接镜检(AODC)法、活菌直接镜检(DVC)法和异养平板计数(HPC)法三者相结合实现对VBNC状态菌的计数。

光学检测法结果直观、清晰,但是细菌种类之间没有区分,可能导致对目标菌株的错误判断。表2为常见的食源性致病菌VBNC状态检测方法比较。

为研究VBNC状态的细菌,除了上述3 种主要的检测方法外,还有酶分析法、种群基因检测法、PMA-CPA检测、免疫荧光和免疫传感器等方法。而大多数方法只考虑了1 种存活参数,如呼吸活性、膜完整性、代谢活性,有一定的局限性。所以测定细胞的活力参数时,需要将几种方式结合,从细胞的形态、呼吸活性和酶活性等方面进行全面分析,使结果更有说服力。

4 结 语

食源性致病菌可在不利于自身生长的环境条件下进入VBNC状态来维持自身生存,反观大多数影响致病菌进入VBNC状态的条件与食品生产加工存储方式密切相关,如低温冷藏、高温消毒、紫外线杀菌以及食品添加剂等。进入VBNC状态而未被杀死的食源性致病菌,一方面会导致常规方法对食源性致病菌VBNC状态的漏检,另一方面会造成食品安全问题。因此针对目前食源性致病菌VBNC状态的研究展望如下:1)加强对VBNC细菌复苏条件优化的研究。从目前的研究来看,VBNC状态细菌复苏主要是采用简单的升温和培养基内添加营养物质的方式,今后应考虑依靠食品基质来提供营养条件复苏,如把VBNC状态的致病菌接种在新鲜水果、蔬菜、肉类上以实现复苏,这样更加接近于食源性致病菌的生存环境;2)深入探讨细菌进入VBNC状态后与正常生理状态下的转录组学差异。目前的研究主要集中在影响细菌进入VBNC的因素,缺乏针对食源性致病菌VBNC状态以及复苏状态下全面的毒力基因、耐药基因、运动相关基因等的表达;目前关于细菌VBNC状态形成及复苏机制研究较少,且不同菌的生理生化特性不同,很难建立统一的机制;在以后的研究中通过转录组学和蛋白组学的联合分析,研究VBNC状态形成机制和复苏机制可能是未来食源性致病菌VBNC状态研究的一个热点;3)研发针对VBNC状态细菌更加全面有效的检测方法。现有方法来看还存在一些不足,如目前对于VBNC状态细菌的检测还无法区分不同状态下的细菌,需要提高灵敏度和精确度,开发更多、更简便的检测方法来避免漏检情况出现,为食品安全检测、疾病预防提供更为有效的方法和途径;4)深入探讨细菌进入VBNC状态的时间。由于检测方法的限制,大部分VBNC细菌仍会逃过检测,并且也无法判断分离检测出的细菌进入VBNC状态的时间,对人类的危害风险评估仍是一个难点;5)研发分离VBNC状态菌的方法。分离VBNC状态菌也是非常困难的,需要研发更准确、高效的技术来突破这一难关;6)深入研究亚致死损伤细胞、休眠细胞、VBNC细胞之间的区别。目前虽有大量研究证明VBNC状态细胞可以复苏成功,但研究VBNC状态复苏成功与否却存在争议,关于复苏的是亚致死细胞还是VBNC细胞尚不清楚,且这两者有极大的相似之处,因此需要深入探讨这几种细胞之间的生理生化特性,以判断真正被复苏的细胞。

本文来源于《食品科学》2023年44卷21期377-385页. 作者:赵青,刘欣,牛洪梅,朱华剑,潘馨叶,刘阳泰,杨捷琳,董庆利

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